SARS-CoV-2 ન્યુટ્રલાઇઝિંગ એન્ટિબોડી ડિટેક્શન કિટ (ELISA)
【સિદ્ધાંત】
SARS-CoV-2 ન્યુટ્રલાઇઝિંગ એન્ટિબોડી ડિટેક્શન કિટ સ્પર્ધાત્મક ELISA પદ્ધતિ પર આધારિત છે.
શુદ્ધ રીસેપ્ટર બાઈન્ડિંગ ડોમેન (RBD), વાયરલ સ્પાઈક (S) પ્રોટીન અને હોસ્ટ સેલમાંથી પ્રોટીનનો ઉપયોગ કરીને
રીસેપ્ટર ACE2, આ પરીક્ષણ વાયરસ-યજમાન તટસ્થ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની નકલ કરવા માટે રચાયેલ છે.
કેલિબ્રેટર્સ, ક્વોલિટી કંટ્રોલ અને સીરમ અથવા પ્લાઝ્મા સેમ્પલ વ્યક્તિગત રીતે મંદીમાં સારી રીતે મિશ્ર કરવામાં આવે છે.
નાની નળીઓમાં અલિકોટેડ hACE2-HRP કન્જુગેટ ધરાવતું બફર. પછી મિશ્રણો ટ્રાન્સફર કરવામાં આવે છે
માઇક્રોપ્લેટ કુવાઓ જેમાં સ્થિર રિકોમ્બિનન્ટ SARS-CoV-2 RBD ફ્રેગમેન્ટ (RBD)
સેવન 30-મિનિટના સેવન દરમિયાન, કેલિબ્રેટરમાં આરબીડી વિશિષ્ટ એન્ટિબોડી, ક્યુસી અને
કુવાઓમાં સ્થિર RBD ને ચોક્કસ બાંધવા માટે નમૂનાઓ hACE2-HRP સાથે સ્પર્ધા કરશે. પછી
ઇન્ક્યુબેશન દરમિયાન, અનબાઉન્ડ hACE2-HRP કન્જુગેટને દૂર કરવા માટે કુવાઓને 4 વખત ધોવામાં આવે છે. નો ઉકેલ
પછી TMB ઉમેરવામાં આવે છે અને ઓરડાના તાપમાને 20 મિનિટ સુધી ઉકાળવામાં આવે છે, પરિણામે a વિકાસ થાય છે
વાદળી રંગ. રંગ વિકાસ 1N HCl ના ઉમેરા સાથે બંધ થાય છે, અને શોષકતા છે
450 nm પર સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક રીતે માપવામાં આવે છે. રચાયેલા રંગની તીવ્રતા પ્રમાણસર છે
એન્ઝાઇમની માત્રા હાજર છે, અને તે જ રીતે માપવામાં આવેલા ધોરણોની માત્રા સાથે વિપરીત રીતે સંબંધિત છે.
પ્રદાન કરેલ કેલિબ્રેટર્સ દ્વારા રચાયેલ કેલિબ્રેશન વળાંક સાથે સરખામણી દ્વારા, ની સાંદ્રતા
પછી અજ્ઞાત નમૂનામાં એન્ટિબોડીઝને તટસ્થ કરવાની ગણતરી કરવામાં આવે છે.
【સામગ્રી જરૂરી છે પરંતુ પૂરી પાડવામાં આવી નથી】
1. નિસ્યંદિત અથવા ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી
2. ચોકસાઇ પાઈપેટ્સ: 10μL, 100μL, 200μL અને 1 mL
3. નિકાલજોગ પીપેટ ટીપ્સ
4. માઇક્રોપ્લેટ રીડર 450nm પર શોષણ વાંચવામાં સક્ષમ છે.
5. શોષક કાગળ
6. ગ્રાફ પેપર
7. વોર્ટેક્સ મિક્સર અથવા સમકક્ષ
【નમૂનો સંગ્રહ અને સંગ્રહ】
1. K2-EDTA ધરાવતી ટ્યુબમાં એકત્ર કરાયેલા સીરમ અને પ્લાઝ્મા સેમ્પલનો ઉપયોગ આ કીટ માટે કરી શકાય છે.
2. નમુનાઓને 2 °C - 8 °C પર તપાસ કરતા પહેલા 48 કલાક સુધી સંગ્રહિત કરી શકાય છે.
લાંબો સમય (6 મહિના સુધી) રાખવામાં આવેલા નમુનાઓને પરીક્ષા પહેલાં માત્ર એક જ વાર -20 °C તાપમાને સ્થિર કરવા જોઈએ.
વારંવાર ફ્રીઝ-થૉ ચક્ર ટાળો.
પ્રોટોકોલ
【રીએજન્ટ તૈયારી】
1. બધા રીએજન્ટ્સ રેફ્રિજરેશનમાંથી બહાર કાઢવા જોઈએ અને ઉપયોગ કરતા પહેલા ઓરડાના તાપમાને પાછા આવવા દેવા જોઈએ
(20° થી 25°C). ઉપયોગ કર્યા પછી તરત જ તમામ રીએજન્ટ્સને રેફ્રિજરેટરમાં સાચવો.
2. બધા નમૂનાઓ અને નિયંત્રણો ઉપયોગ કરતા પહેલા વમળમાં હોવા જોઈએ.
3. hACE2-HRP સોલ્યુશનની તૈયારી: hACE2-HRP કોન્સન્ટ્રેટને 1:51 મંદન સાથે મંદ કરો
બફર. ઉદાહરણ તરીકે, 100 μL hACE2-HRP કોન્સન્ટ્રેટને 5.0mL HRP ડિલ્યુશન બફર સાથે પાતળું કરો
hACE2-HRP સોલ્યુશન બનાવો.
4. 1× વૉશ સોલ્યુશનની તૈયારી: 20× વૉશ સોલ્યુશનને ડીયોનાઇઝ્ડ અથવા નિસ્યંદિત પાણી સાથે પાતળું કરો
વોલ્યુમ રેશિયો 1:19. ઉદાહરણ તરીકે, 20×વોશ સોલ્યુશનના 20 એમએલને ડીયોનાઇઝ્ડ અથવા 380 એમએલ સાથે પાતળું કરો.
1× વોશ સોલ્યુશનનું 400 એમએલ બનાવવા માટે નિસ્યંદિત પાણી.
【ટેસ્ટ પ્રક્રિયા】
1. અલગ ટ્યુબમાં, તૈયાર hACE2-HRP સોલ્યુશનનું અલીકોટ 120μL.
2. દરેક ટ્યુબમાં 6 μL કેલિબ્રેટર, અજાણ્યા નમૂનાઓ, ગુણવત્તા નિયંત્રણો ઉમેરો અને સારી રીતે ભળી દો.
3. સ્ટેપ 2 માં તૈયાર કરેલ દરેક મિશ્રણનું 100μL અનુરૂપ માઇક્રોપ્લેટ કુવાઓમાં સ્થાનાંતરિત કરો
પૂર્વ-ડિઝાઇન કરેલ પરીક્ષણ રૂપરેખાંકન માટે.
3. પ્લેટને પ્લેટ સીલર વડે ઢાંકો અને 37°C તાપમાને 30 મિનિટ માટે પકાવો.
4. પ્લેટ સીલરને દૂર કરો અને પ્લેટને આશરે 300 μL ના 1× વૉશ સોલ્યુશન પ્રતિ કૂવા ચાર વખત ધોઈ લો.
5. પગથિયાં ધોયા પછી કુવાઓમાં રહેલ પ્રવાહીને દૂર કરવા કાગળના ટુવાલ પર પ્લેટને ટેપ કરો.
6. દરેક કૂવામાં 100 μL TMB સોલ્યુશન ઉમેરો અને પ્લેટને અંધારામાં 20 - 25°C તાપમાને 20 મિનિટ માટે ઉકાળો.
7. પ્રતિક્રિયા રોકવા માટે દરેક કૂવામાં 50 μL સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરો.
8. 10 મિનિટની અંદર 450 એનએમ પર માઇક્રોપ્લેટ રીડરમાં શોષણ વાંચો (એસેસરી તરીકે 630nm
ઉચ્ચ ચોકસાઇ કામગીરી માટે ભલામણ કરેલ).