Kit de detección de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPIO】
O kit de detección de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 baséase na metodoloxía ELISA competitiva.
Usando o dominio de unión ao receptor purificado (RBD), a proteína da proteína espiga viral (S) e a célula hóspede
receptor ACE2, esta proba está deseñada para imitar a interacción de neutralización virus-hóspede.
Os calibradores, os controis de calidade e as mostras de soro ou plasma mestúranse ben individualmente en dilución
tampón que contén o conxugado hACE2-HRP alícuotado en pequenos tubos.Despois, as mesturas son transferidas
os pozos da microplaca que conteñen o fragmento RBD SARS-CoV-2 recombinante inmobilizado (RBD) para
incubación.Durante a incubación de 30 minutos, o anticorpo específico RBD nos calibradores, QC e
as mostras competirán co hACE2-HRP pola unión específica do RBD inmobilizado nos pozos.Despois
A incubación, os pozos lávanse 4 veces para eliminar o conxugado hACE2-HRP non unido.Unha solución de
Despois engádese TMB e incúbase durante 20 minutos a temperatura ambiente, dando como resultado o desenvolvemento de a
cor azul.O desenvolvemento da cor deténse coa adición de HCl 1N, e a absorbancia é
medida espectrofotométricamente a 450 nm.A intensidade da cor formada é proporcional á
cantidade de encima presente, e está inversamente relacionada coa cantidade de patróns ensaiados do mesmo xeito.
Mediante a comparación coa curva de calibración formada polos calibradores proporcionados, a concentración de
A continuación calcúlanse os anticorpos neutralizantes na mostra descoñecida.
【MATERIAIS NECESARIOS PERO NON PROPORCIONADOS】
1. Auga destilada ou desionizada
2. Pipetas de precisión: 10μL, 100μL, 200μL e 1 ml
3. Puntas de pipetas desbotables
4. Lector de microplacas capaz de ler absorbancias a 450 nm.
5. Papel absorbente
6. Papel cuadriculado
7. Mesturador vórtice ou equivalente
【RECOLLIDA E ALMACENAMENTO DE MOSTRAS】
1. Para este kit pódense utilizar mostras de soro e plasma recollidas en tubos que conteñen K2-EDTA.
2. As mostras deben estar tapadas e pódense almacenar ata 48 horas a 2 °C - 8 °C antes da análise.
As mostras mantidas durante máis tempo (ata 6 meses) deben conxelarse só unha vez a -20 °C antes do ensaio.
Evite os ciclos de conxelación-desconxelación repetidos.
PROTOCOLO
【Preparación de reactivos】
1. Todos os reactivos deben ser retirados da refrixeración e deixar que volvan á temperatura ambiente antes do seu uso
(20° a 25°C).Garda todos os reactivos no frigorífico inmediatamente despois do uso.
2. Todas as mostras e controis deben ser vórtex antes do seu uso.
3. Preparación da solución de hACE2-HRP: diluír o concentrado de hACE2-HRP nunha proporción de dilución de 1: 51 con Dilución
Tampón.Por exemplo, dilúa 100 μl de concentrado de hACE2-HRP con 5,0 ml de tampón de dilución de HRP para
facer unha solución hACE2-HRP.
4. Preparación da solución de lavado 1×: diluír a solución de lavado 20× con auga desionizada ou destilada cun
relación de volume de 1:19.Por exemplo, dilúa 20 ml de solución de lavado 20× con 380 ml de solución desionizada ou
auga destilada para facer 400 ml de solución de lavado 1×.
【Procedemento da proba】
1. En tubos separados, alícuota 120μL da solución hACE2-HRP preparada.
2. Engadir 6 μL de calibradores, mostras descoñecidas, controis de calidade en cada tubo e mesturar ben.
3. Transfira 100 μL de cada mestura preparada no paso 2 aos pozos correspondentes de microplaca segundo
a configuración de proba prediseñado.
3. Cubra a placa con Plate Sealer e incube a 37 °C durante 30 minutos.
4. Retire o selador de placas e lave a placa con aproximadamente 300 μL de solución de lavado 1× por pozo durante catro veces.
5. Toca o prato sobre unha toalla de papel para eliminar o líquido residual dos pozos despois dos pasos de lavado.
6. Engade 100 μL de solución de TMB a cada pozo e incube a placa na escuridade a 20 - 25 °C durante 20 minutos.
7. Engade 50 μL de solución de parada a cada pozo para deter a reacción.
8. Lea a absorbancia no lector de microplacas a 450 nm en 10 minutos (630 nm como accesorio
recomendado para un rendemento de maior precisión).
