SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PRINSIPE】
De SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit is basearre op kompetitive ELISA-metodology.
Gebrûk fan suvere receptor binding domein (RBD), proteïne fan it virale spike (S) proteïne en de gasthearsel
ACE2-receptor, dizze test is ûntworpen om de firus-host-neutralisearjende ynteraksje te mimikjen.
Kalibrators, kwaliteitskontrôles, en serum- of plasmamonsters wurde yndividueel goed mingd yn verdunning
buffer mei hACE2-HRP konjugaat aliquotearre yn lytse buizen. Dan wurde de mingsels oerbrocht yn
de mikroplaatputten dy't ymmobilisearre rekombinante SARS-CoV-2 RBD-fragmint (RBD) befetsje foar
ynkubaasje. Tidens de 30-minuten ynkubaasje, de RBD spesifyk antykody yn 'e calibrators, QC en
Samples sille konkurrearje mei de hACE2-HRP foar spesifike bining fan 'e RBD ymmobilisearre yn' e putten. Nei
de ynkubaasje, de putten wurde wosken 4 kear te ferwiderjen unbound hACE2-HRP konjugaat. In oplossing fan
TMB wurdt dan tafoege en ynkubeare foar 20 minuten by keamertemperatuer, wat resulteart yn 'e ûntwikkeling fan in
blauwe kleur. De kleurûntwikkeling wurdt stoppe mei de tafoeging fan 1N HCl, en de absorption is
spektrofotometrysk mjitten by 450 nm. De yntinsiteit fan de foarme kleur is evenredich mei de
bedrach fan enzyme oanwêzich, en is omkeard besibbe oan it bedrach fan noarmen assayed op deselde wize.
Troch ferliking mei de kalibraasje kromme foarme troch de foarsjoen calibrators, de konsintraasje fan
Neutralisearjende antykladen yn it ûnbekende stekproef wurdt dan berekkene.
【MATERIALEN FERGESE MAAR NET FERGESE】
1. Destillearre of deionisearre wetter
2. Precision pipetten: 10μL, 100μL, 200μL en 1 mL
3. Disposable pipette tips
4. Microplate-lêzer dy't by steat is om absorbance te lêzen op 450nm.
5. Absorberend papier
6. Grafyk papier
7. Vortex mixer of lykweardich
【SPECIMEN KOLLEKSJE EN STORAGE】
1. Serum- en plasmamonsters sammele yn buizen mei K2-EDTA kinne brûkt wurde foar dizze kit.
2. Eksimplaren moatte wurde kapt en kinne wurde opslein foar oant 48 oeren by 2 ° C - 8 ° C foarôfgeand oan assaying.
Eksimplaren dy't foar in langere tiid hâlden wurde (oant 6 moannen) moatte mar ien kear beferzen wurde by -20 ° C foarôfgeand oan assay.
Foarkom werhelle freeze-thaw-syklusen.
PROTOKOL
【Reagent Preparation】
1. Alle reagents moatte wurde nommen út de kuolkast en tastien om werom nei keamertemperatuer foar gebrûk
(20° oant 25°C). Bewarje alle reagenzjes yn 'e kuolkast fuortendaliks nei gebrûk.
2. Alle samples en kontrôles moatte foar gebrûk vortexed wurde.
3. Tarieding fan hACE2-HRP-oplossing: Verdunne hACE2-HRP-konsintraasje by 1: 51-dilution ratio mei Dilution
Buffer. Ferdinne bygelyks 100 μL hACE2-HRP-konsintraat mei 5.0mL HRP-ferdunningsbuffer om
meitsje in hACE2-HRP oplossing.
4. 1× Wash Solution Tarieding: Verdun de 20× Wash Solution mei deionisearre of destillearre wetter mei in
folume ferhâlding fan 1:19. Ferdinne bygelyks 20 ml 20 × waskoplossing mei 380 ml deionisearre of
destillearre wetter om 400 mL fan 1 × Wash Solution te meitsjen.
【Testproseduere】
1. Yn aparte buizen, aliquot 120μL fan 'e taret hACE2-HRP Solution.
2. Foegje 6 μL fan kalibrators, ûnbekende samples, kwaliteitskontrôles yn elke buis en mingje goed.
3. Oerstapje 100μL fan elk mingsel dat yn 'e stap 2 taret is yn oerienkommende microplate wells neffens
nei foarôfûntwerp testkonfiguraasje.
3. Cover de plaat mei Plate Sealer en incubate op 37 ° C foar 30 minuten.
4. Fuortsmite de Plate Sealer en waskje de plaat mei likernôch 300 μL fan 1 × Wash Solution per well foar fjouwer kear.
5. Tap de plaat op papieren handdoek om oerbliuwende flüssigens yn 'e putten te ferwiderjen nei it waskjen fan stappen.
6. Foegje 100 μL fan TMB-oplossing oan elke boarne en ynkubearje de plaat yn tsjuster op 20 - 25 ° C foar 20 minuten.
7. Foegje 50 μL fan Stop Solution oan elke boarne om de reaksje te stopjen.
8. Lês de absorption yn mikroplaatlêzer op 450 nm binnen 10 minuten (630nm as accessoire is
oanrikkemandearre foar prestaasjes mei hegere presyzje).