Kit de détection d'anticorps neutralisants SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPE】
Le kit de détection d’anticorps neutralisants SARS-CoV-2 est basé sur une méthodologie ELISA compétitive.
Utilisation du domaine de liaison au récepteur (RBD) purifié, de la protéine de la protéine Spike (S) virale et de la cellule hôte
récepteur ACE2, ce test est conçu pour imiter l’interaction neutralisante virus-hôte.
Les calibrateurs, les contrôles qualité et les échantillons de sérum ou de plasma sont bien mélangés individuellement en dilution
tampon contenant le conjugué hACE2-HRP aliquoté dans de petits tubes.Ensuite, les mélanges sont transférés dans
les puits de la microplaque contenant le fragment RBD (RBD) recombinant du SARS-CoV-2 immobilisé pour
incubation.Pendant l'incubation de 30 minutes, l'anticorps spécifique RBD dans les calibrateurs, QC et
les échantillons entreront en compétition avec le hACE2-HRP pour la liaison spécifique au RBD immobilisé dans les puits.Après
Après l'incubation, les puits sont lavés 4 fois pour éliminer le conjugué hACE2-HRP non lié.Une solution de
Le TMB est ensuite ajouté et incubé pendant 20 minutes à température ambiante, ce qui entraîne le développement d'un
couleur bleue.Le développement de la couleur est stoppé par l'ajout de HCl 1N et l'absorbance est
mesuré par spectrophotométrie à 450 nm.L'intensité de la couleur formée est proportionnelle à la
quantité d'enzyme présente et est inversement proportionnelle à la quantité d'étalons analysés de la même manière.
Par comparaison avec la courbe d'étalonnage formée par les calibrateurs fournis, la concentration de
les anticorps neutralisants dans l’échantillon inconnu sont ensuite calculés.
【MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI】
1. Eau distillée ou déminéralisée
2. Pipettes de précision : 10μL, 100μL,200μL et 1 mL
3. Embouts de pipettes jetables
4. Lecteur de microplaques capable de lire l'absorbance à 450 nm.
5. Papier absorbant
6. Papier millimétré
7. Mélangeur vortex ou équivalent
【COLLECTE ET STOCKAGE DES ÉCHANTILLONS】
1. Des échantillons de sérum et de plasma collectés dans des tubes contenant du K2-EDTA peuvent être utilisés pour ce kit.
2. Les échantillons doivent être bouchés et peuvent être conservés jusqu'à 48 heures entre 2 °C et 8 °C avant l'analyse.
Les échantillons conservés pendant une période plus longue (jusqu'à 6 mois) doivent être congelés une seule fois à -20 °C avant le test.
Évitez les cycles de gel-dégel répétés.
PROTOCOLE
【Préparation des réactifs】
1. Tous les réactifs doivent être sortis du réfrigérateur et laissés revenir à température ambiante avant utilisation.
(20° à 25°C).Conservez tous les réactifs au réfrigérateur immédiatement après utilisation.
2. Tous les échantillons et contrôles doivent être vortexés avant utilisation.
3. Préparation de la solution hACE2-HRP : Diluer le concentré de hACE2-HRP au rapport de dilution de 1 : 51 avec Dilution.
Tampon.Par exemple, diluez 100 μL de concentré hACE2-HRP avec 5,0 ml de tampon de dilution HRP pour
faire une solution hACE2-HRP.
4. Préparation de la solution de lavage 1× : Diluer la solution de lavage 20× avec de l'eau déionisée ou distillée avec un
rapport de volume de 1:19.Par exemple, diluez 20 ml de solution de lavage 20× avec 380 ml de solution désionisée ou
eau distillée pour préparer 400 ml de solution de lavage 1×.
【Procédure de test】
1. Dans des tubes séparés, aliquotez 120 μL de la solution hACE2-HRP préparée.
2. Ajouter 6 μL de calibrateurs, d'échantillons inconnus, de contrôles qualité dans chaque tube et bien mélanger.
3. Transférez 100 μL de chaque mélange préparé à l'étape 2 dans les puits de microplaques correspondants selon
à une configuration de test prédéfinie.
3. Couvrir la plaque avec Plate Sealer et incuber à 37°C pendant 30 minutes.
4. Retirez le scellant pour plaque et lavez la plaque avec environ 300 μL de solution de lavage 1 × par puits quatre fois.
5. Tapotez la plaque sur une serviette en papier pour éliminer le liquide résiduel dans les puits après les étapes de lavage.
6. Ajoutez 100 μL de solution TMB dans chaque puits et incubez la plaque dans l'obscurité à 20 - 25°C pendant 20 minutes.
7. Ajoutez 50 μL de solution d'arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.
8. Lire l'absorbance dans un lecteur de microplaques à 450 nm dans les 10 minutes (630 nm en tant qu'accessoire est
recommandé pour des performances de plus grande précision).
