SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PERIAATE】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit perustuu kilpailukykyiseen ELISA-menetelmään.
Käyttämällä puhdistettua reseptoria sitovaa domeenia (RBD), proteiinia viruksen piikkiproteiinista (S) ja isäntäsolusta
ACE2-reseptori, tämä testi on suunniteltu jäljittelemään virus-isäntä neutraloivaa vuorovaikutusta.
Kalibraattorit, laadunvalvontalaitteet ja seerumi- tai plasmanäytteet sekoitetaan yksitellen hyvin laimennettuna
puskuri, joka sisältää hACE2-HRP-konjugaattia pieniin putkiin jaettuina.Sitten seokset siirretään sisään
mikrolevykuopat, jotka sisältävät immobilisoitua rekombinantti SARS-CoV-2 RBD-fragmenttia (RBD) varten
inkubaatio.30 minuutin inkubaation aikana RBD-spesifinen vasta-aine kalibraattoreissa, QC ja
näytteet kilpailevat hACE2-HRP:n kanssa kuoppiin immobilisoidun RBD:n spesifisestä sitomisesta.Jälkeen
Inkuboinnin aikana kuopat pestään 4 kertaa sitoutumattoman hACE2-HRP-konjugaatin poistamiseksi.Ratkaisu
Sitten lisätään TMB:tä ja inkuboidaan 20 minuuttia huoneenlämpötilassa, mikä johtaa a
sininen väri.Värin kehittyminen pysäytetään lisäämällä 1 N HCl:a ja absorbanssi on
mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm:ssä.Muodostuneen värin intensiteetti on verrannollinen
läsnä olevan entsyymin määrä, ja se on käänteisessä suhteessa samalla tavalla määritettyjen standardien määrään.
Vertaamalla toimitettujen kalibraattoreiden muodostamaan kalibrointikäyrään saadaan pitoisuus
sitten lasketaan neutraloivien vasta-aineiden määrä tuntemattomassa näytteessä.
【VAADITTAVAT MATERIAALIT, MUTTA EI TOIMITETA】
1. Tislattu tai deionisoitu vesi
2. Tarkkuuspipetit: 10 μL, 100 μL, 200 μL ja 1 ml
3. Kertakäyttöiset pipetin kärjet
4. Mikrolevylukija, joka pystyy lukemaan absorbanssin 450 nm:ssä.
5. Imukykyinen paperi
6. Kaaviopaperi
7. Vortex-sekoitin tai vastaava
【NÄYTTEEN KERÄÄMINEN JA SÄILYTYS】
1. K2-EDTA:ta sisältäviin putkiin kerättyjä seerumi- ja plasmanäytteitä voidaan käyttää tässä sarjassa.
2. Näytteet on suljettava ja niitä voidaan säilyttää enintään 48 tuntia 2 °C - 8 °C:ssa ennen määritystä.
Näytteet, joita on säilytetty pidempään (enintään 6 kuukautta), tulee pakastaa vain kerran -20 °C:ssa ennen määritystä.
Vältä toistuvia pakastus-sulatusjaksoja.
PROTOKOLLA
【Reagenssin valmistus】
1. Kaikki reagenssit on otettava pois jääkaapista ja annettava palata huoneenlämpöiseksi ennen käyttöä
(20 - 25 °C).Säilytä kaikki reagenssit jääkaapissa heti käytön jälkeen.
2. Kaikki näytteet ja kontrollit tulee vorteksoida ennen käyttöä.
3. hACE2-HRP-liuoksen valmistus: Laimenna hACE2-HRP-konsentraatti laimennussuhteessa 1:51 laimennuksella
Puskuri.Laimenna esimerkiksi 100 µl hACE2-HRP-konsentraattia 5,0 ml:lla HRP-laimennuspuskuria
tee hACE2-HRP-ratkaisu.
4. 1 × pesuliuoksen valmistus: Laimenna 20 × pesuliuos deionisoidulla tai tislatulla vedellä
tilavuussuhde 1:19.Laimenna esimerkiksi 20 ml 20-kertaista pesuliuosta 380 ml:lla deionisoitua tai
tislattua vettä, jotta saadaan 400 ml 1 x pesuliuosta.
【TESTAUSMENETTELY】
1. Jaa erillisiin putkiin 120 µl valmistettua hACE2-HRP-liuosta.
2. Lisää jokaiseen putkeen 6 μL kalibraattoreita, tuntemattomia näytteitä, laadunvalvontalaitteita ja sekoita hyvin.
3. Siirrä 100 μl kutakin vaiheessa 2 valmistettua seosta vastaaviin mikrolevyn kuoppiin
ennalta suunniteltuun testikokoonpanoon.
3. Peitä levy Plate Sealerillä ja inkuboi 37 °C:ssa 30 minuuttia.
4. Poista levytiiviste ja pese levy noin 300 μl:lla 1× pesuliuosta kuoppaa kohti neljä kertaa.
5. Napauta levyä paperipyyhkeellä poistaaksesi kuopista pesuvaiheiden jälkeen jäänyt neste.
6. Lisää 100 µl TMB-liuosta jokaiseen kuoppaan ja inkuboi levyä pimeässä 20 - 25 °C:ssa 20 minuuttia.
7. Lisää 50 μL pysäytysliuosta kuhunkin kuoppaan reaktion pysäyttämiseksi.
8. Lue absorbanssi mikrolevylukijasta 450 nm:ssä 10 minuutin sisällä (630 nm lisävarusteena
suositellaan paremman tarkkuuden saavuttamiseksi).
