کیت تشخیص آنتی بادی SARS-COV-2 (ELISA)
【اصل】
کیت تشخیص آنتی بادی خنثی کننده SARS-COV-2 بر اساس روش رقابتی ELISA است.
با استفاده از دامنه اتصال گیرنده خالص (RBD) ، پروتئین از پروتئین سنبله ویروسی و سلول میزبان
گیرنده ACE2 ، این آزمایش برای تقلید از تعامل خنثی کننده ویروس میزبان ویروس طراحی شده است.
کالیبراسیون ، کنترل کیفیت و نمونه های سرم یا پلاسما به صورت جداگانه در رقیق شدن به خوبی مخلوط می شوند
بافر حاوی HACE2-HRP کونژوگه شده در لوله های کوچک. سپس مخلوط ها به داخل منتقل می شوند
چاههای میکروپلیت حاوی قطعه نوترکیب بی حرکت SARS-COV-2 RBD (RBD) برای
جوجه کشی در طی جوجه کشی 30 دقیقه ای ، آنتی بادی خاص RBD در کالیبراسیون ، QC و
نمونه ها برای اتصال خاص RBD بی حرکت در چاه ها با HACE2-HRP رقابت می کنند. پس از
جوجه کشی ، چاه ها 4 بار شسته می شوند تا کونژوگه بدون مرز HACE2-HRP را از بین ببرند. یک راه حل از
TMB سپس به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق اضافه و انکوبه می شود و در نتیجه ایجاد یک
رنگ آبی توسعه رنگ با افزودن هیدروکلراید 1N متوقف می شود و میزان جذب آن است
اندازه گیری اسپکتروفتومتری در 450 نانومتر. شدت رنگ تشکیل شده متناسب با
مقدار آنزیم موجود است و به طور معکوس با میزان استانداردهای سنجیده شده به همان روش مرتبط است.
از طریق مقایسه با منحنی کالیبراسیون تشکیل شده توسط کالیبراسیون های ارائه شده ، غلظت
آنتی بادی های خنثی کننده در نمونه ناشناخته سپس محاسبه می شود.
【مواد مورد نیاز اما ارائه نشده است】
1. آب مقطر یا دیونیزه شده
2. پیپت های دقیق: 10μL ، 100μL ، 200μL و 1 میلی لیتر
3. نکات پیپت یکبار مصرف
4. خواننده میکروپلیت قادر به خواندن جذب در 450 نانومتر است.
5. کاغذ جاذب
6. کاغذ گراف
7. میکسر یا معادل آن گرداب
【جمع آوری و ذخیره نمونه】
1. نمونه سرم و پلاسما جمع آوری شده در لوله های حاوی K2-EDTA برای این کیت قابل استفاده است.
2. نمونه ها باید بسته شوند و ممکن است تا 48 ساعت در دمای 2 درجه سانتیگراد - 8 درجه سانتیگراد قبل از سنجش ذخیره شوند.
نمونه هایی که برای مدت طولانی تر (حداکثر 6 ماه) برگزار می شود ، باید فقط یک بار در دمای 20 درجه سانتیگراد قبل از سنجش یخ زده شوند.
از چرخه های مکرر یخ زدگی خودداری کنید.
پروتکل
【آماده سازی معرف】
1. همه معرفها باید از یخچال خارج شوند و اجازه دهند قبل از استفاده به دمای اتاق برگردند
(20 تا 25 درجه سانتیگراد). پس از استفاده ، تمام معرفها را در یخچال ذخیره کنید.
2. کلیه نمونه ها و کنترل ها باید قبل از استفاده گرداب شوند.
آماده سازی محلول HACE2-HRP: کنسانتره HACE2-HRP را در نسبت رقیق 1: 51 با رقیق کردن رقیق کنید
بافر به عنوان مثال ، 100 میکرولیتر کنسانتره HACE2-HRP را با 5.0 میلی لیتر بافر رقت HRP به
یک راه حل HACE2-HRP تهیه کنید.
4. آماده سازی محلول شست
نسبت حجم 1:19. به عنوان مثال ، 20 میلی لیتر محلول شستشوی 20 × با 380 میلی لیتر دیونیزه یا
آب مقطر برای تهیه 400 میلی لیتر محلول شستشوی 1 ×.
【روش آزمایش】
1. در لوله های جداگانه ، 120μl از محلول HACE2-HRP آماده شده.
2. 6 میکرولیتر از کالیبراسیون ، نمونه های ناشناخته ، کنترل کیفیت در هر لوله را اضافه کرده و به خوبی مخلوط کنید.
3. 100μl از هر مخلوط تهیه شده در مرحله 2 را به چاههای میکروپلیت مربوطه با توجه به
برای پیکربندی آزمون از پیش تعیین شده.
3 صفحه را با مهر و موم بشقاب بپوشانید و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
سیلر صفحه را برداشته و صفحه را با تقریباً 300 میکرولیتر از محلول شستشوی 1 × در هر چاه برای چهار بار بشویید.
5. روی حوله کاغذی روی صفحه را بزنید تا مایع باقیمانده در چاهها پس از شستشو از بین برود.
6. 100 میکرولیتر محلول TMB را به هر چاه اضافه کرده و صفحه را در تاریکی با دمای 20 - 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه انکوبه کنید.
7. 50 میکرولیتر محلول توقف را به هر چاه اضافه کنید تا واکنش متوقف شود.
8. میزان جذب در میکروپلیت خوان را در 450 نانومتر در طی 10 دقیقه بخوانید (630 نانومتر به عنوان لوازم جانبی
برای عملکرد دقیق بالاتر توصیه می شود).