کیت تشخیص آنتی بادی خنثی کننده SARS-CoV-2 (ELISA)
【اصل】
کیت تشخیص آنتی بادی خنثی کننده SARS-CoV-2 بر اساس روش ELISA رقابتی است.
با استفاده از دامنه اتصال گیرنده خالص (RBD)، پروتئین از پروتئین اسپایک ویروسی (S) و سلول میزبان
گیرنده ACE2، این تست برای تقلید از تعامل خنثی کننده ویروس-میزبان طراحی شده است.
کالیبراتورها، کنترل‌های کیفیت، و نمونه‌های سرم یا پلاسما به‌صورت جداگانه به خوبی در رقت مخلوط می‌شوند.
بافر حاوی کونژوگه hACE2-HRP در لوله های کوچک تقسیم شده است. سپس مخلوط ها به داخل منتقل می شوند
چاه های میکروپلیت حاوی قطعه RBD (RBD) نوترکیب SARS-CoV-2 بی حرکت برای
جوجه کشی در طی 30 دقیقه انکوباسیون، آنتی بادی اختصاصی RBD در کالیبراتورها، QC و
نمونه ها با hACE2-HRP برای اتصال ویژه RBD بی حرکت در چاه ها رقابت خواهند کرد. بعد از
در انکوباسیون، چاهک ها 4 بار شسته می شوند تا مزدوج hACE2-HRP حذف شود. راه حلی از
سپس TMB اضافه می شود و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود که منجر به ایجاد a
رنگ آبی توسعه رنگ با افزودن 1N HCl متوقف می شود و جذب کاهش می یابد
اسپکتروفتومتری در 450 نانومتر اندازه گیری شد. شدت رنگ تشکیل شده متناسب با
مقدار آنزیم موجود، و به طور معکوس با مقدار استانداردهای سنجش شده به همان روش مرتبط است.
از طریق مقایسه با منحنی کالیبراسیون تشکیل شده توسط کالیبراتورهای ارائه شده، غلظت
سپس آنتی بادی های خنثی کننده در نمونه ناشناخته محاسبه می شود.
【مواد مورد نیاز اما ارائه نشده است】
1. آب مقطر یا دیونیزه
2. پیپت های دقیق: 10 میکرولیتر، 100 میکرولیتر، 200 میکرولیتر و 1 میلی لیتر
3. نوک پیپت یکبار مصرف
4. میکروپلیت خوان قادر به خواندن جذب در 450nm.
5. کاغذ جاذب
6. کاغذ نمودار
7. میکسر گرداب یا معادل آن
【جمع آوری و ذخیره سازی نمونه】
1. نمونه های سرم و پلاسما جمع آوری شده در لوله های حاوی K2-EDTA را می توان برای این کیت استفاده کرد.
2. نمونه ها باید درپوش داشته باشند و ممکن است تا 48 ساعت در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد قبل از سنجش نگهداری شوند.
نمونه هایی که برای مدت طولانی تری (تا 6 ماه) نگهداری می شوند باید فقط یک بار در دمای 20- درجه سانتیگراد قبل از سنجش منجمد شوند.
از تکرار چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید.
پروتکل
【آماده سازی معرف】
1. تمام معرف ها باید از یخچال خارج شده و قبل از استفاده به دمای اتاق برگردند
(20 تا 25 درجه سانتیگراد). تمام معرف ها را بلافاصله پس از استفاده در یخچال نگهداری کنید.
2. تمام نمونه ها و کنترل ها باید قبل از استفاده گردابی شوند.
3. تهیه محلول hACE2-HRP: کنسانتره hACE2-HRP را با نسبت رقت 1:51 با رقیق سازی رقیق کنید.
بافر. به عنوان مثال، 100 میکرولیتر از کنسانتره hACE2-HRP را با 5.0 میلی لیتر بافر رقت HRP رقیق کنید تا
یک محلول hACE2-HRP بسازید.
4. تهیه محلول شستشو 1×: محلول شستشوی 20× را با آب دیونیزه یا مقطر رقیق کنید.
نسبت حجم 1:19 به عنوان مثال، 20 میلی لیتر از محلول شستشوی 20× را با 380 میلی لیتر از دیونیزه یا رقیق کنید.
آب مقطر برای تهیه 400 میلی لیتر محلول شستشو 1×.
【روش تست】
1. در لوله های جداگانه، 120μL از محلول hACE2-HRP تهیه شده را به مقدار کافی مصرف کنید.
2. 6 میکرولیتر کالیبراتور، نمونه های ناشناخته، کنترل های کیفیت را در هر لوله اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
3. 100μL از هر مخلوط تهیه شده در مرحله 2 را به چاه های میکروپلیت مربوطه منتقل کنید.
به پیکربندی آزمایشی از پیش طراحی شده
3. روی صفحه را با Plate Sealer بپوشانید و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
4. Plate Sealer را بردارید و صفحه را با تقریباً 300 میکرولیتر محلول شستشو 1× در هر چاه برای چهار بار بشویید.
5. بشقاب را روی حوله کاغذی بزنید تا پس از مراحل شستشو، مایع باقی مانده در چاهک ها خارج شود.
6. 100 میکرولیتر محلول TMB را به هر چاهک اضافه کنید و بشقاب را در تاریکی در دمای 20 تا 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه انکوبه کنید.
7. 50 میکرولیتر محلول توقف به هر چاه اضافه کنید تا واکنش متوقف شود.
8. جذب را در میکروپلیت ریدر در 450 نانومتر در عرض 10 دقیقه بخوانید (630 نانومتر به عنوان لوازم جانبی
برای عملکرد با دقت بالاتر توصیه می شود).