SARS-CoV-2 antigorputz neutralizatzaileak detektatzeko kit (ELISA)
【PRINTZIPIOA】
SARS-CoV-2 Antigorputz Neutralizatzaileen Detekzio Kita ELISA metodologia lehiakorrean oinarritzen da.
Hartzaileen lotura-domeinu araztua (RBD), Spike birikoaren (S) proteinaren proteina eta ostalari zelula erabiliz
ACE2 hartzaileak, proba hau birus-ostalari neutralizatzeko elkarrekintza imitatzeko diseinatuta dago.
Kalibragailuak, Kalitate Kontrolak eta serum edo plasma laginak banaka ondo nahasten dira diluzioan
hodi txikietan hACE2-HRP konjokatua duen buffer. Ondoren, nahasketak sartzen dira
SARS-CoV-2 RBD zati (RBD) errekonbinatzaile inmobilizatua duten mikroplaken putzuak.
inkubazioa. 30 minutuko inkubazioan, RBD antigorputz espezifikoa kalibragailuetan, QC eta
laginak hACE2-HRPrekin lehiatuko dira putzuetan inmobilizatutako RBD berariaz lotzeko. Ondoren
inkubazioan, putzuak 4 aldiz garbitzen dira lotu gabeko hACE2-HRP konjugatua kentzeko. ren irtenbide bat
Ondoren, TMB gehitu eta 20 minutuz inkubatzen da giro-tenperaturan, eta ondorioz a garatzen da
kolore urdina. Kolorearen garapena 1N HCl gehitzearekin gelditzen da, eta xurgapena
450 nm-an espektrofotometrikoki neurtua. Eratutako kolorearen intentsitatea proportzionala da
dagoen entzima-kopurua, eta modu berean saiatutako estandar-kopuruarekin alderantziz erlazionatuta dago.
Emandako kalibragailuek osatzen duten kalibrazio-kurbarekin konparatuz, kontzentrazioa
Ondoren, lagin ezezagunean antigorputzak neutralizatzaileak kalkulatzen dira.
【BEHARREZKO MATERIALAK BAINA EMATEN EZ】
1. Ur destilatu edo desionizatua
2. Zehaztasun pipetak: 10μL, 100μL, 200μL eta 1 ml
3. Pipeta botatzeko puntak
4. Mikroplaken irakurgailua 450nm-tan absorbantzia irakurtzeko gai dena.
5. Paper xurgatzailea
6. Paper milimetratua
7. Vortex nahasgailua edo baliokidea
【ALEAK BILKETA ETA BILTEGIRATZEA】
1. K2-EDTA duten hodietan bildutako serum eta plasma laginak erabil daitezke kit honetarako.
2. Laginak estali egin behar dira eta 48 orduz gorde daitezke 2 °C - 8 °C-tan saiakuntza egin aurretik.
Denbora luzeagoan gordetako aleak (6 hilabetera arte) behin bakarrik izoztu behar dira -20 °C-tan azterketa egin aurretik.
Saihestu izozte-desizozte ziklo errepikatuak.
PROTOKOLOA
【Erreaktiboak prestatzea】
1. Erreaktibo guztiak hozkailutik atera eta giro-tenperaturara itzultzen utzi behar dira erabili aurretik
(20° eta 25°C). Erabili ondoren, gorde erreaktibo guztiak hozkailuan.
2. Erabili aurretik, lagin eta kontrol guztiak biribildu behar dira.
3. hACE2-HRP konponbidea prestatzea: diluitu hACE2-HRP kontzentratua 1: 51 diluzio-erlazioan Diluzioarekin
Buffer. Esate baterako, diluitu 100 μL hACE2-HRP kontzentratu 5,0 ml HRP diluzio-bufferrekin.
egin hACE2-HRP soluzio bat.
4. 1× Garbiketa Disoluzioa Prestatzea: Diluitu 20× Garbiketa Disoluzioa ur deionizatu edo destilatuarekin
bolumen-erlazioa 1:19. Esate baterako, diluitu 20 ml 20x garbiketa soluzio 380 ml deionizatu edo
ur destilatua 1× garbiketa-disoluzio 400 ml egiteko.
【Prozedura Prozedura】
1. Hodi bereizietan, prestatutako hACE2-HRP disoluzioaren 120μL alikuota.
2. Gehitu 6 μL kalibragailu, lagin ezezagunak, kalitate kontrolak hodi bakoitzean eta ondo nahastu.
3. Transferitu 2. urratsean prestatutako nahasketa bakoitzaren 100μL dagozkion mikroplaken putzuetara.
aurrez diseinatutako proba-konfiguraziora.
3. Estali plaka Plate Sealer-ekin eta inkubatu 37 °C-tan 30 minutuz.
4. Kendu plaka zigilatzailea eta garbitu plaka 300 μL gutxi gorabehera 1× garbiketa-disoluzioarekin hobi bakoitzeko lau aldiz.
5. Ukitu plaka paperezko eskuoihalaren gainean, garbiketa-urratsen ondoren putzuetan geratzen den likidoa kentzeko.
6. Gehitu 100 μL TMB soluzio putzu bakoitzean eta inkubatu plaka ilunpean 20 - 25 °C-tan 20 minutuz.
7. Gehitu 50 μL Stop Solution putzu bakoitzean erreakzioa geldiarazteko.
8. Irakurri mikroplaken irakurgailuaren absorbantzia 450 nm-ra 10 minututan (630 nm osagarri gisa).
zehaztasun handiagoko errendimendurako gomendatua).