SARS-CoV-2 neutraliseerivate antikehade tuvastamise komplekt (ELISA)
【PÕHIMÕTE】
SARS-CoV-2 neutraliseerivate antikehade tuvastamise komplekt põhineb konkureerival ELISA metoodikal.
Kasutades puhastatud retseptorit siduvat domeeni (RBD), viiruse spike (S) valku ja peremeesrakku
retseptori ACE2, see test on loodud viiruse ja peremeesorganismi neutraliseeriva interaktsiooni jäljendamiseks.
Kalibraatorid, kvaliteedikontrollid ja seerumi- või plasmaproovid segatakse individuaalselt hästi lahjendatud kujul
puhvrit, mis sisaldab hACE2-HRP konjugaati, jaotatuna väikestesse tuubidesse.Seejärel kantakse segud sisse
mikroplaadi süvendid, mis sisaldavad immobiliseeritud rekombinantset SARS-CoV-2 RBD fragmenti (RBD)
inkubeerimine.30-minutise inkubeerimise ajal on RBD spetsiifiline antikeha kalibraatorites, QC ja
proovid konkureerivad hACE2-HRP-ga süvenditesse immobiliseeritud RBD spetsiifilise sidumise osas.Pärast
Inkubeerimisel pestakse süvendeid 4 korda, et eemaldada seondumata hACE2-HRP konjugaat.Lahendus,
Seejärel lisatakse TMB ja inkubeeritakse 20 minutit toatemperatuuril, mille tulemusena areneb a
sinine värv.Värvuse tekkimine peatatakse 1 N HCl lisamisega ja neeldumine on
mõõdeti spektrofotomeetriliselt 450 nm juures.Moodustunud värvi intensiivsus on võrdeline
ensüümi kogust ja on pöördvõrdeline samal viisil analüüsitud standardite kogusega.
Võrreldes kaasasolevate kalibraatorite moodustatud kalibreerimiskõveraga, saab kontsentratsiooni
Seejärel arvutatakse tundmatus proovis neutraliseerivad antikehad.
【VAJALIK, KUID EI OLE ESITATUD MATERJALID】
1. Destilleeritud või deioniseeritud vesi
2. Täppispipetid: 10 μL, 100 μL, 200 μL ja 1 ml
3. Ühekordsed pipetiotsad
4. Mikroplaadilugeja, mis suudab lugeda neeldumist 450 nm juures.
5. Imav paber
6. Graafikupaber
7. Vortex segisti või samaväärne
【PROOVIDE KOGUMINE JA SÄILITAMINE】
1. Selle komplekti jaoks võib kasutada K2-EDTA-d sisaldavatesse tuubidesse kogutud seerumi- ja plasmaproove.
2. Proovid tuleb enne analüüsimist katta ja neid võib hoida kuni 48 tundi temperatuuril 2 °C – 8 °C.
Pikemat aega (kuni 6 kuud) hoitud proove tuleb enne analüüsi külmutada ainult üks kord temperatuuril -20 °C.
Vältige korduvaid külmutamise-sulatamise tsükleid.
PROTOKOLL
【Reaktiivi ettevalmistamine】
1. Enne kasutamist tuleb kõik reaktiivid külmkapist välja võtta ja lasta neil soojeneda toatemperatuurini
(20° kuni 25°C).Hoidke kõik reaktiivid kohe pärast kasutamist külmikusse.
2. Kõiki proove ja kontrolle tuleb enne kasutamist vorteksiga segada.
3. hACE2-HRP lahuse valmistamine: lahjendage hACE2-HRP kontsentraati lahjendussuhtega 1:51 lahusega Lahjendus
Puhver.Näiteks lahjendage 100 μL hACE2-HRP kontsentraati 5,0 ml HRP lahjenduspuhvriga, et
teha hACE2-HRP lahendus.
4. 1 × pesulahuse valmistamine: lahjendage 20 × pesulahust deioniseeritud või destilleeritud veega
mahusuhe 1:19.Näiteks lahjendage 20 ml 20-kordset pesulahust 380 ml deioniseeritud või
destilleeritud vett, et saada 400 ml 1x pesulahust.
【Testimisprotseduur】
1. Eraldi tuubidesse jaotage 120 μL valmistatud hACE2-HRP lahust.
2. Lisage igasse katsutisse 6 μL kalibraatoreid, tundmatuid proove, kvaliteedikontrolli ja segage hästi.
3. Viige 100 μL igast etapis 2 valmistatud segust vastavatesse mikroplaadi süvenditesse vastavalt
eelprojekteeritud testikonfiguratsioonile.
3. Katke plaat Plate Sealer'iga ja inkubeerige 37 °C juures 30 minutit.
4. Eemaldage plaadisulgur ja peske plaati neli korda ligikaudu 300 μL 1× pesulahusega süvendi kohta.
5. Koputage plaati paberrätikule, et pärast pesemist eemaldada süvenditest jääkvedelik.
6. Lisage igasse süvendisse 100 μL TMB lahust ja inkubeerige plaati pimedas temperatuuril 20–25 °C 20 minutit.
7. Reaktsiooni peatamiseks lisage igasse süvendisse 50 μL stopplahust.
8. Lugege 10 minuti jooksul neeldumist mikroplaadi lugejas lainepikkusel 450 nm (tarvikuna 630 nm
soovitatav suurema täpsuse saavutamiseks).
