Kit de detección de anticuerpos neutralizantes SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPIO】
El kit de detección de anticuerpos neutralizantes SARS-CoV-2 se basa en la metodología ELISA competitiva.
Utilizando el dominio de unión del receptor purificado (RBD), la proteína de la proteína (S) viral (S) y la célula huésped
Receptor ACE2, esta prueba está diseñada para imitar la interacción neutralizante de virus-huésped.
Los calibradores, los controles de calidad y las muestras de suero o de plasma se mezclan individualmente bien en la dilución
Buffer que contiene conjugado HACE2-HRP alícuotado en tubos pequeños. Entonces las mezclas se transfieren en
Los pozos de microplaca que contienen fragmento RBD sars-CoV-2 recombinante inmovilizado (RBD) para
incubación. Durante la incubación de 30 minutos, el anticuerpo específico de RBD en los calibradores, QC y
Las muestras competirán con el HACE2-HRP para una unión específica, el RBD inmovilizado en los pocillos. Después
La incubación, los pozos se lavan 4 veces para eliminar el conjugado HACE2-HRP no unido. Una solución de
Luego se agrega y se incuba TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente, lo que resulta en el desarrollo de un
color azul. El desarrollo del color se detiene con la adición de 1n HCl, y la absorbancia es
Medido espectrofotométricamente a 450 nm. La intensidad del color formado es proporcional al
Cantidad de enzima presente, y está inversamente relacionada con la cantidad de estándares analizados de la misma manera.
A través de la comparación con la curva de calibración formada por los calibradores proporcionados, la concentración de
Luego se calcula los anticuerpos neutralizantes en la muestra desconocida.
【Materiales requeridos pero no proporcionados】
1. Agua destilada o desionizada
2. Pipetas de precisión: 10 μl, 100 μl, 200 μl y 1 ml
3. Consejos de pipeta desechables
4. Lector de microplacas capaz de leer la absorbancia a 450 nm.
5. Papel absorbente
6. Papel cuadriculado
7. Mezclador de vórtice o equivalente
【Colección y almacenamiento de muestras】
1. Se pueden usar muestras de suero y plasma en tubos que contienen K2-EDTA para este kit.
2. Las muestras deben limitarse y se pueden almacenar hasta 48 horas a 2 ° C - 8 ° C antes de analizar.
Las muestras mantenidas durante más tiempo (hasta 6 meses) deben congelarse solo una vez a -20 ° C antes del ensayo.
Evite los repetidos ciclos de congelación-descongelación.
PROTOCOLO
【Preparación de reactivos】
1. Todos los reactivos deben ser sacados de la refrigeración y se les permite volver a la temperatura ambiente antes de usar
(20 ° a 25 ° C). Guarde todos los reactivos en el refrigerador de inmediato después de su uso.
2. Todas las muestras y controles deben ser vórtice antes de su uso.
3. Preparación de la solución HACE2-HRP: diluir concentrado de HACE2-HRP a la relación de dilución 1: 51 con dilución
Buffer. Por ejemplo, diluya 100 μl de hace2-hrp concentrado con 5.0 ml de tampón de dilución HRP a
Haga una solución HACE2-HRP.
4. 1 × Preparación de la solución de lavado: diluya la solución de lavado 20 × con agua desionizada o destilada con un
Relación de volumen de 1:19. Por ejemplo, diluya 20 ml de solución de 20 × lavado con 380 ml de desionizado o
Agua destilada para hacer 400 ml de solución de 1 × lavado.
【Procedimiento de prueba】
1. En tubos separados, alícuota 120 μl de la solución HACE2-HRP preparada.
2. Agregue 6 μl de calibradores, muestras desconocidas, controles de calidad en cada tubo y mezcle bien.
3. Transfiera 100 μl de cada mezcla preparada en el paso 2 a los pozos de microplacas correspondientes según
a la configuración de prueba prediseñada.
3. Cubra la placa con sellador de placa e incube a 37 ° C durante 30 minutos.
4. Retire el sellador de la placa y lave la placa con aproximadamente 300 μl de solución de 1 × de lavado por pozo para cuatro veces.
5. Toque la placa sobre la toalla de papel para eliminar el líquido residual en los pozos después de lavar los escalones.
6. Agregue 100 μl de solución TMB a cada pocillo e incube la placa en la oscuridad a 20 - 25 ° C durante 20 minutos.
7. Agregue 50 μl de solución de parada a cada pozo para detener la reacción.
8. Lea la absorbancia en el lector de microplacas a 450 nm en 10 minutos (630 nm a medida que el accesorio es
Recomendado para un mayor rendimiento de precisión).