Kit de detección de anticuerpos neutralizantes (ELISA) del SARS-CoV-2
【PRINCIPIO】
El kit de detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 se basa en una metodología ELISA competitiva.
Utilizando el dominio de unión al receptor (RBD) purificado, la proteína de la proteína de pico viral (S) y la célula huésped
receptor ACE2, esta prueba está diseñada para imitar la interacción neutralizante virus-huésped.
Los calibradores, controles de calidad y muestras de suero o plasma se mezclan bien individualmente en dilución.
tampón que contiene el conjugado hACE2-HRP en alícuotas en tubos pequeños. Luego las mezclas se transfieren en
los pocillos de la microplaca que contienen el fragmento RBD recombinante del SARS-CoV-2 (RBD) para
incubación. Durante la incubación de 30 minutos, el anticuerpo específico de RBD en los calibradores, QC y
las muestras competirán con hACE2-HRP por la unión específica del RBD inmovilizado en los pocillos. Después
Después de la incubación, los pocillos se lavan 4 veces para eliminar el conjugado hACE2-HRP no unido. una solución de
Luego se agrega TMB y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente, lo que da como resultado el desarrollo de un
color azul. El desarrollo del color se detiene con la adición de HCl 1 N y se mide la absorbancia.
medido espectrofotométricamente a 450 nm. La intensidad del color formado es proporcional a la
cantidad de enzima presente, y está inversamente relacionada con la cantidad de estándares analizados de la misma manera.
A través de la comparación con la curva de calibración formada por los calibradores proporcionados, la concentración de
Luego se calculan los anticuerpos neutralizantes en la muestra desconocida.
【MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS】
1. Agua destilada o desionizada
2. Pipetas de precisión: 10 μl, 100 μl, 200 μl y 1 ml
3. Puntas de pipeta desechables
4. Lector de microplacas capaz de leer absorbancia a 450 nm.
5. Papel absorbente
6. Papel cuadriculado
7. Mezclador Vortex o equivalente
【RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS】
1. Para este kit se pueden utilizar muestras de suero y plasma recogidas en tubos que contienen K2-EDTA.
2. Las muestras deben taparse y pueden almacenarse hasta 48 horas a una temperatura entre 2 °C y 8 °C antes del análisis.
Las muestras conservadas durante más tiempo (hasta 6 meses) deben congelarse solo una vez a -20 °C antes del ensayo.
Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.
PROTOCOLO
【Preparación de reactivos】
1. Todos los reactivos deben sacarse de la refrigeración y permitirse que vuelvan a la temperatura ambiente antes de su uso.
(20° a 25°C). Guarde todos los reactivos en el refrigerador inmediatamente después de su uso.
2. Todas las muestras y controles deben agitarse antes de su uso.
3. Preparación de la solución hACE2-HRP: Diluya el concentrado de hACE2-HRP en una proporción de dilución de 1:51 con Dilución
Buffer. Por ejemplo, diluya 100 μL de concentrado de hACE2-HRP con 5,0 ml de tampón de dilución HRP para
hacer una solución hACE2-HRP.
4. Preparación de la solución de lavado 1×: Diluya la solución de lavado 20× con agua desionizada o destilada con un
Relación de volumen de 1:19. Por ejemplo, diluya 20 ml de solución de lavado 20X con 380 ml de solución desionizada o
agua destilada para preparar 400 ml de solución de lavado 1×.
【Procedimiento de prueba】
1. En tubos separados, tome alícuotas de 120 μl de la solución hACE2-HRP preparada.
2. Agregue 6 μL de calibradores, muestras desconocidas y controles de calidad en cada tubo y mezcle bien.
3. Transfiera 100 μL de cada mezcla preparada en el paso 2 a los pocillos de microplaca correspondientes de acuerdo con
a la configuración de prueba prediseñadas.
3. Cubra la placa con Plate Sealer e incube a 37°C durante 30 minutos.
4. Retire el sellador de placas y lave la placa con aproximadamente 300 μl de solución de lavado 1× por pocillo cuatro veces.
5. Golpee la placa sobre una toalla de papel para eliminar el líquido residual en los pocillos después de los pasos de lavado.
6. Agregue 100 μL de solución TMB a cada pocillo e incube la placa en la oscuridad a 20 - 25 °C durante 20 minutos.
7. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción.
8. Lea la absorbancia en un lector de microplacas a 450 nm en 10 minutos (630 nm como accesorio).
recomendado para un rendimiento de mayor precisión).