SARS-CoV-2 Neŭtraliga Antikorpa Detekta Ilaro (ELISA)
【PRINCIPO】
La Neutralizing Antibody Detection Kit de SARS-CoV-2 baziĝas sur konkurenciva ELISA-metodaro.
Uzante purigitan receptoran ligan domajnon (RBD), proteinon de la viruspikilo (S) proteino kaj la gastiga ĉelo
receptoro ACE2, ĉi tiu testo estas dizajnita por imiti la virus-gastiganton neŭtraligan interagon.
Kalibriloj, Kvalitkontroloj kaj serumaj aŭ plasmaj specimenoj estas individue miksitaj bone en diluo
bufro enhavanta hACE2-HRP-konjugaton alikvotita en malgrandaj tuboj.Tiam la miksaĵoj estas translokigitaj enen
la mikroplataj putoj enhavantaj senmovigan rekombinan SARS-CoV-2 RBD fragmenton (RBD) por
kovado.Dum la 30-minuta kovado, la RBD-specifa antikorpo en la kalibriloj, QC kaj
specimenoj konkuros kun la hACE2-HRP por specifa ligado de la RBD senmovigita en la putoj.Post
la kovado, la putoj estas lavitaj 4 fojojn por forigi neligitan hACE2-HRP-konjugaton.Solvo de
TMB tiam estas aldonita kaj kovita dum 20 minutoj ĉe ĉambra temperaturo, rezultigante la evoluon de a
blua koloro.La kolordisvolviĝo estas ĉesigita kun aldono de 1N HCl, kaj la absorbado estas
mezurita spektrofotometrie je 450 nm.La intenseco de la formita koloro estas proporcia al la
kvanto de enzimo ĉeestanta, kaj estas inverse rilata al la kvanto de normoj analizitaj en la sama maniero.
Tra komparo kun la kalibra kurbo formita de la provizitaj kalibriloj, la koncentriĝo de
neŭtraligantaj antikorpoj en la nekonata provaĵo tiam estas kalkulita.
【MATERIOJ NECESATAS SED NE PROVIZITAJ】
1. Distilita aŭ dejonigita akvo
2. Precizaj pipetoj: 10μL, 100μL, 200μL kaj 1 ml
3. Forĵeteblaj pipetkonsiletoj
4. Mikroplata leganto kapabla legi absorbadon ĉe 450nm.
5. Sorba papero
6. Grafikpapero
7. Vortex-miksilo aŭ ekvivalento
【KOLEKTO KAJ STOKADO DE SPECIMENJN】
1. Serumaj kaj Plasmaj specimenoj kolektitaj en tuboj enhavantaj K2-EDTA povas esti uzataj por ĉi tiu ilaro.
2. Specimenoj devas esti kovritaj kaj povas esti konservitaj ĝis 48 horoj je 2 °C - 8 °C antaŭ analizo.
Specimenoj tenitaj dum pli longa tempo (ĝis 6 monatoj) devas esti frostigitaj nur unufoje je -20 °C antaŭ analizo.
Evitu ripetajn ciklojn de frosto-degelo.
PROTOKOLO
【Preparado de Reakciilo】
1. Ĉiuj reakciiloj devas esti prenitaj el fridigo kaj permesitaj reveni al ĉambra temperaturo antaŭ uzo
(20° ĝis 25°C).Konservu ĉiujn reakcilojn en la fridujo tuj post uzo.
2. Ĉiuj specimenoj kaj kontroloj devas esti vortexitaj antaŭ uzo.
3. hACE2-HRP Solvo-Preparo: Diluu hACE2-HRP-koncentraĵon ĉe 1: 51-dilua proporcio kun Diluo
Bufro.Ekzemple, diluu 100 μL da hACE2-HRP-koncentraĵo kun 5.0mL da HRP-Dilua Buffer al
faru solvon de hACE2-HRP.
4. 1× Lava Solvo-Preparo: Diluu la 20× Lavan Solvon per dejonigita aŭ distilita akvo per
volumenoproporcio de 1:19.Ekzemple, diluu 20 mL da 20× Lava Solvo kun 380 mL da dejonigita aŭ
distilita akvo por fari 400 ml de 1× Lava Solvo.
【Proceduro】
1. En apartaj tuboj, alikvoto 120μL de la preta hACE2-HRP Solvo.
2. Aldonu 6 μL da kalibriloj, nekonataj specimenoj, kvalitkontroloj en ĉiu tubo kaj miksu bone.
3. Transloku 100μL de ĉiu miksaĵo preparita en la paŝo 2 en respondajn mikroplatajn putojn laŭ
al antaŭdizajnita testa agordo.
3. Kovru la teleron per Plate Sealer kaj kovu je 37 °C dum 30 minutoj.
4. Forigu la Platan Sigelilon kaj lavu la teleron per proksimume 300 μL da 1× Lava Solvo po kvar fojojn.
5. Frapu la teleron sur papera tuko por forigi restan likvaĵon en la putoj post lavado de paŝoj.
6. Aldonu 100 μL da TMB-Solvo al ĉiu puto kaj kovu la teleron en mallumo je 20 - 25 °C dum 20 minutoj.
7. Aldonu 50 μL da Haltiga Solvo al ĉiu puto por ĉesigi la reagon.
8. Legu la absorbadon en mikroplata leganto je 450 nm ene de 10 minutoj (630nm kiel akcesoraĵo estas
rekomendita por pli alta precizeca agado).
