SARS-COV-2 Neŭtraliganta Antikorpan Detektan Kiton (ELISA)
【Principo】
La SARS-COV-2 neŭtraliganta antikorpan detektan kiton baziĝas sur konkurenciva ELISA-metodaro.
Uzante purigitan receptoron liganta domajnon (RBD), proteinon de la viral -spike (S) proteino kaj la gastiga ĉelo
Receptoro ACE2, ĉi tiu provo estas desegnita por imiti la virus-gastigan neŭtraligan interagadon.
Kalibroj, kvalitaj kontroloj, kaj serumaj aŭ plasmaj specimenoj estas individue miksitaj bone en diluo
bufro enhavanta HACE2-HRP konjugacian alikotitan en malgrandaj tuboj. Tiam la miksaĵoj estas translokigitaj en
la mikroplataj putoj enhavantaj senmovigitan rekombinan SARS-COV-2 RBD-fragmenton (RBD) por
inkubacio. Dum la 30-minuta kovado, la RBD-specifa antikorpo en la kalibroj, QC kaj
Specimenoj konkuros kun la HACE2-HRP por specifa ligado de la RBD senmovigita en la putoj. Post
La kovado, la putoj estas lavitaj 4 fojojn por forigi nelimigitan HACE2-HRP-konjugacion. Solvo de
TMB tiam estas aldonita kaj inkubita dum 20 minutoj ĉe ĉambra temperaturo, rezultigante la disvolviĝon de
blua koloro. La kolora disvolviĝo ĉesas kun la aldono de 1N HCl, kaj la absorbanco estas
mezurita spektrofotometriko ĉe 450 nm. La intenseco de la koloro formita estas proporcia al la
Kvanto de enzimo ĉeestanta, kaj inverse rilatas al la kvanto de normoj testitaj sammaniere.
Per komparo kun la kalibra kurbo formita de la provizitaj kalibroj, la koncentriĝo de
Neŭtraligantaj antikorpoj en la nekonata specimeno tiam estas kalkulitaj.
【Materialoj bezonataj sed ne provizitaj】
1. Distilita aŭ deionigita akvo
2. Precizaj pipetoj: 10μl, 100μl, 200μl kaj 1 mL
3. Disponeblaj Pipetaj Konsiletoj
4. Mikroplata leganto kapabla legi absorbancon ĉe 450nm.
5. Absorba Papero
6. Grafika Papero
7. Vortex -miksilo aŭ ekvivalento
【Specimenkolekto kaj stokado】
1. Serum kaj plasmaj specimenoj kolektitaj en tuboj enhavantaj K2-EDTA povas esti uzataj por ĉi tiu ilaro.
2. Specimenoj devas esti ĉapelitaj kaj povas esti stokitaj ĝis 48 horoj je 2 ° C - 8 ° C antaŭ ol testi.
Specimenoj tenitaj dum pli longa tempo (ĝis 6 monatoj) devas esti frostigitaj nur unufoje je -20 ° C antaŭ provo.
Evitu ripetitajn frostajn thaw-ciklojn.
Protokolo
【Reagenta Preparo】
1. Ĉiuj reaktivoj devas esti elprenitaj el fridujo kaj permesitaj reveni al ĉambra temperaturo antaŭ uzo
(20 ° ĝis 25 ° C). Konservu ĉiujn reaktivojn en fridujo senprokraste post uzo.
2. Ĉiuj specimenoj kaj kontroloj devas esti vortumitaj antaŭ uzo.
3. HACE2-HRP-solva preparado: diluita HACE2-HRP-koncentriĝo ĉe 1: 51 dilua rilatumo kun diluo
Bufro. Ekzemple, diluu 100 µl da HACE2-HRP-koncentriĝo kun 5.0ml de HRP-dilua bufro al
Faru solvon HACE2-HRP.
4. 1 × Lavu Solva Preparado: Diluu la 20 × lavan solvon kun deionigita aŭ distilita akvo kun a
volumena rilatumo de 1:19. Ekzemple, diluu 20 ml da 20 × lavita solvo kun 380 ml da deionigita aŭ
Distilita akvo por fari 400 ml da 1 × lavita solvo.
【Prova Proceduro】
1. En apartaj tuboj, alikoto 120μl de la preparita HACE2-HRP-solvo.
2. Aldonu 6 µl da kalibroj, nekonatajn specimenojn, kvalitajn kontrolojn en ĉiu tubo kaj miksi bone.
3. Transdonu 100μl de ĉiu miksaĵo preparita en la paŝo 2 en respondajn microplatajn putojn laŭ
al antaŭdestinita testo -agordo.
3. Kovru la teleron per plata sigelilo kaj inkubu je 37 ° C dum 30 minutoj.
4. Forigu la platan sigelilon kaj lavu la teleron kun proksimume 300 µl da 1 × lavita solvo po puto kvar fojojn.
5. Frapu la teleron sur papera mantuko por forigi postrestantan likvaĵon en la putoj post lavado de ŝtupoj.
6. Aldonu 100 µl da TMB -solvo al ĉiu puto kaj inkubu la teleron en mallumo je 20 - 25 ° C dum 20 minutoj.
7. Aldonu 50 µl da halta solvo al ĉiu puto por ĉesigi la reagon.
8. Legu la absorbancon en Microplate Reader je 450 nm ene de 10 minutoj (630nm kiel akcesoraĵo estas
Rekomendita por pli alta preciza agado).