Κιτ ανίχνευσης αντισωμάτων εξουδετέρωσης SARS-CoV-2 (ELISA)
【ΑΡΧΗ】
Το κιτ ανίχνευσης αντισωμάτων εξουδετέρωσης SARS-CoV-2 βασίζεται στην ανταγωνιστική μεθοδολογία ELISA.
Χρησιμοποιώντας καθαρή περιοχή σύνδεσης υποδοχέα (RBD), πρωτεΐνη από την πρωτεΐνη ιικής ακίδας (S) και το κύτταρο ξενιστή
υποδοχέα ACE2, αυτή η δοκιμή έχει σχεδιαστεί για να μιμείται την αλληλεπίδραση εξουδετέρωσης ιού-ξενιστή.
Οι βαθμονομητές, οι ποιοτικοί έλεγχοι και τα δείγματα ορού ή πλάσματος αναμιγνύονται μεμονωμένα καλά σε αραίωση
ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει συζυγές hACE2-HRP σε υποπολλαπλάσια τμήματα σε μικρούς σωλήνες. Στη συνέχεια τα μείγματα μεταφέρονται μέσα
τα φρεάτια μικροπλάκας που περιέχουν ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο θραύσμα SARS-CoV-2 RBD (RBD) για
επώαση. Κατά τη διάρκεια της επώασης 30 λεπτών, το ειδικό αντίσωμα RBD στους βαθμονομητές, QC και
Τα δείγματα θα ανταγωνίζονται το hACE2-HRP για ειδική δέσμευση του RBD που είναι ακινητοποιημένο στα φρεάτια. Μετά
κατά την επώαση, τα φρεάτια πλένονται 4 φορές για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο συζυγές hACE2-HRP. Μια λύση του
Στη συνέχεια προστίθεται TMB και επωάζεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη α
μπλε χρώμα. Η ανάπτυξη χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη 1Ν HCl και η απορρόφηση είναι
μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm. Η ένταση του χρώματος που σχηματίζεται είναι ανάλογη του
ποσότητα του ενζύμου που υπάρχει, και σχετίζεται αντιστρόφως με την ποσότητα των προτύπων που προσδιορίζονται με τον ίδιο τρόπο.
Μέσω σύγκρισης με την καμπύλη βαθμονόμησης που σχηματίζεται από τους παρεχόμενους βαθμονομητές, η συγκέντρωση των
Στη συνέχεια υπολογίζονται τα εξουδετερωτικά αντισώματα στο άγνωστο δείγμα.
【ΥΛΙΚΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΛΛΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ】
1. Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό
2. Πιπέτες ακριβείας: 10μL, 100μL,200μL και 1 mL
3. Ρύγχη πιπέτας μιας χρήσης
4. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με δυνατότητα ανάγνωσης απορρόφησης στα 450 nm.
5. Απορροφητικό χαρτί
6. Γραφικό χαρτί
7. Μίκτης Vortex ή αντίστοιχο
【ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ】
1. Δείγματα ορού και πλάσματος που συλλέγονται σε σωληνάρια που περιέχουν K2-EDTA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για αυτό το κιτ.
2. Τα δείγματα πρέπει να καλύπτονται με πώμα και μπορούν να φυλάσσονται για έως και 48 ώρες στους 2 °C - 8 °C πριν από τον προσδιορισμό.
Τα δείγματα που διατηρούνται για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (έως 6 μήνες) πρέπει να καταψύχονται μόνο μία φορά στους -20 °C πριν από την ανάλυση.
Αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης.
ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ
【Παρασκευή αντιδραστηρίου】
1. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αφαιρούνται από το ψυγείο και να αφήνονται να επανέλθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση
(20° έως 25°C). Φυλάξτε όλα τα αντιδραστήρια στο ψυγείο αμέσως μετά τη χρήση.
2. Όλα τα δείγματα και οι μάρτυρες θα πρέπει να στροβιλίζονται πριν από τη χρήση.
3. Παρασκευή διαλύματος hACE2-HRP: Αραιώστε το συμπύκνωμα hACE2-HRP σε αναλογία αραίωσης 1:51 με αραίωση
Ρυθμιστής. Για παράδειγμα, αραιώστε 100 μL συμπυκνώματος hACE2-HRP με 5,0 mL ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης HRP σε
φτιάξτε ένα διάλυμα hACE2-HRP.
4. 1× Προετοιμασία διαλύματος πλύσης: Αραιώστε το διάλυμα πλύσης 20× με απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό με
αναλογία όγκου 1:19. Για παράδειγμα, αραιώστε 20 mL διαλύματος πλύσης 20× με 380 mL απιονισμένου ή
απεσταγμένο νερό για να παρασκευαστούν 400 mL 1× διαλύματος πλύσης.
【Διαδικασία δοκιμής】
1. Σε ξεχωριστά σωληνάρια, πάρτε 120μL από το παρασκευασμένο Διάλυμα hACE2-HRP.
2. Προσθέστε 6 μL βαθμονομητών, άγνωστα δείγματα, ποιοτικούς ελέγχους σε κάθε σωληνάριο και ανακατέψτε καλά.
3. Μεταφέρετε 100μL από κάθε μείγμα που παρασκευάστηκε στο βήμα 2 σε αντίστοιχα φρεάτια μικροπλάκας σύμφωνα με
σε προσχεδιασμένη διαμόρφωση δοκιμής.
3. Καλύψτε την πλάκα με Plate Sealer και επωάστε στους 37°C για 30 λεπτά.
4. Αφαιρέστε το Plate Sealer και πλύνετε την πλάκα με περίπου 300 μL 1× Wash Solution ανά φρεάτιο για τέσσερις φορές.
5. Χτυπήστε το πιάτο σε χαρτοπετσέτα για να αφαιρέσετε τα υπολείμματα υγρού στα φρεάτια μετά τα βήματα πλύσης.
6. Προσθέστε 100 μL διαλύματος TMB σε κάθε φρεάτιο και επωάστε την πλάκα στο σκοτάδι στους 20 - 25°C για 20 λεπτά.
7. Προσθέστε 50 μL Διαλύματος Διακοπής σε κάθε φρεάτιο για να σταματήσετε την αντίδραση.
8. Διαβάστε την απορρόφηση σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 450 nm μέσα σε 10 λεπτά (630 nm ως εξάρτημα είναι
συνιστάται για απόδοση υψηλότερης ακρίβειας).