Kit zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINZIP】
Das Kit zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 basiert auf der kompetitiven ELISA-Methodik.
Unter Verwendung gereinigter Rezeptorbindungsdomäne (RBD), Protein aus dem viralen Spike (S)-Protein und der Wirtszelle
Dieser Test wurde entwickelt, um die neutralisierende Interaktion zwischen Virus und Wirt nachzuahmen.
Kalibratoren, Qualitätskontrollen und Serum- oder Plasmaproben werden einzeln gut verdünnt gemischt
Puffer mit hACE2-HRP-Konjugat, aliquotiert in kleinen Röhrchen. Anschließend werden die Mischungen eingefüllt
Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte enthalten immobilisiertes rekombinantes SARS-CoV-2-RBD-Fragment (RBD) für
Inkubation. Während der 30-minütigen Inkubation wird der RBD-spezifische Antikörper in den Kalibratoren, QC und
Die Proben konkurrieren mit hACE2-HRP um die spezifische Bindung des in den Vertiefungen immobilisierten RBD. Nach
Nach der Inkubation werden die Vertiefungen viermal gewaschen, um ungebundenes hACE2-HRP-Konjugat zu entfernen. Eine Lösung von
Anschließend wird TMB zugegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, was zur Entwicklung von a führt
blaue Farbe. Durch Zugabe von 1N HCl wird die Farbentwicklung gestoppt und die Absorption erhöht
spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Intensität der gebildeten Farbe ist proportional zur
Menge des vorhandenen Enzyms und steht im umgekehrten Verhältnis zur Menge der auf die gleiche Weise getesteten Standards.
Durch Vergleich mit der von den bereitgestellten Kalibratoren erstellten Kalibrierungskurve kann die Konzentration von
Anschließend werden neutralisierende Antikörper in der unbekannten Probe berechnet.
【ERFORDERLICHE, ABER NICHT ZUR VERFÜGUNG GESTELLTE MATERIALIEN】
1. Destilliertes oder entionisiertes Wasser
2. Präzisionspipetten: 10 μL, 100 μL, 200 μL und 1 ml
3. Einweg-Pipettenspitzen
4. Mikroplatten-Lesegerät, das die Absorption bei 450 nm messen kann.
5. Saugfähiges Papier
6. Millimeterpapier
7. Vortex-Mischer oder gleichwertiges Gerät
【PROBENSAMMLUNG UND LAGERUNG】
1. Für dieses Kit können Serum- und Plasmaproben verwendet werden, die in Röhrchen mit K2-EDTA gesammelt wurden.
2. Die Proben sollten verschlossen werden und können vor der Untersuchung bis zu 48 Stunden bei 2 °C – 8 °C gelagert werden.
Proben, die über einen längeren Zeitraum (bis zu 6 Monate) aufbewahrt werden, sollten vor dem Test nur einmal bei -20 °C eingefroren werden.
Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
PROTOKOLL
【Reagenzvorbereitung】
1. Alle Reagenzien müssen vor der Verwendung aus dem Kühlschrank genommen und auf Raumtemperatur gebracht werden
(20° bis 25°C). Bewahren Sie alle Reagenzien sofort nach Gebrauch im Kühlschrank auf.
2. Alle Proben und Kontrollen sollten vor der Verwendung gemischt werden.
3. Vorbereitung der hACE2-HRP-Lösung: Verdünnen Sie das hACE2-HRP-Konzentrat im Verdünnungsverhältnis 1:51 mit „Dilution“.
Puffer. Verdünnen Sie beispielsweise 100 μl hACE2-HRP-Konzentrat mit 5,0 ml HRP-Verdünnungspuffer
Erstellen Sie eine hACE2-HRP-Lösung.
4. Vorbereitung der 1× Waschlösung: Verdünnen Sie die 20× Waschlösung mit entionisiertem oder destilliertem Wasser mit a
Volumenverhältnis von 1:19. Verdünnen Sie beispielsweise 20 ml 20-fache Waschlösung mit 380 ml entionisiertem oder
destilliertes Wasser, um 400 ml 1× Waschlösung herzustellen.
【Testverfahren】
1. Aliquotieren Sie in separaten Röhrchen 120 μl der vorbereiteten hACE2-HRP-Lösung.
2. 6 μl Kalibratoren, unbekannte Proben und Qualitätskontrollen in jedes Röhrchen geben und gut mischen.
3. Übertragen Sie 100 μl jeder in Schritt 2 hergestellten Mischung in die entsprechenden Mikrotiterplattenvertiefungen
zur vorgefertigten Testkonfiguration.
3. Decken Sie die Platte mit Plate Sealer ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
4. Entfernen Sie den Plattenversiegeler und waschen Sie die Platte viermal mit etwa 300 μl 1× Waschlösung pro Vertiefung.
5. Klopfen Sie die Platte nach den Waschschritten auf ein Papiertuch, um Restflüssigkeit in den Vertiefungen zu entfernen.
6. Geben Sie 100 μl TMB-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang im Dunkeln bei 20–25 °C.
7. Geben Sie 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.
8. Lesen Sie die Absorption im Mikroplatten-Lesegerät bei 450 nm innerhalb von 10 Minuten ab (630 nm als Zubehör).
empfohlen für eine höhere Präzisionsleistung).