SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【PRINCIP】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit er baseret på konkurrerende ELISA-metodologi.
Ved at bruge oprenset receptorbindingsdomæne (RBD), protein fra viral spike (S) protein og værtscellen
receptor ACE2, er denne test designet til at efterligne virus-værts neutraliserende interaktion.
Kalibratorer, kvalitetskontroller og serum- eller plasmaprøver blandes individuelt godt i fortynding
buffer indeholdende hACE2-HRP-konjugat fordelt i små rør. Derefter overføres blandingerne ind
mikropladebrøndene, der indeholder immobiliseret rekombinant SARS-CoV-2 RBD-fragment (RBD) for
inkubation. Under den 30-minutters inkubation vil det RBD-specifikke antistof i kalibratorerne, QC og
prøver vil konkurrere med hACE2-HRP om specifik binding til RBD immobiliseret i brøndene. Efter
inkubationen vaskes brøndene 4 gange for at fjerne ubundet hACE2-HRP-konjugat. En løsning af
TMB tilsættes derefter og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur, hvilket resulterer i udviklingen af en
blå farve. Farveudviklingen standses ved tilsætning af 1N HCl, og absorbansen er
målt spektrofotometrisk ved 450 nm. Intensiteten af den dannede farve er proportional med
mængden af tilstedeværende enzym og er omvendt relateret til mængden af standarder analyseret på samme måde.
Gennem sammenligning med kalibreringskurven dannet af de medfølgende kalibratorer kan koncentrationen af
neutraliserende antistoffer i den ukendte prøve beregnes derefter.
【MATERIALER PÅKRÆVET MEN IKKE LEVERET】
1. Destilleret eller deioniseret vand
2. Præcisionspipetter: 10μL, 100μL, 200μL og 1 mL
3. Engangspipettespidser
4. Mikropladelæser, der kan aflæse absorbans ved 450 nm.
5. Absorberende papir
6. Grafpapir
7. Vortex mixer eller tilsvarende
【PRØVEINDSAMLING OG OPBEVARING】
1. Serum- og plasmaprøver opsamlet i rør indeholdende K2-EDTA kan bruges til dette kit.
2. Prøver skal have låg og kan opbevares i op til 48 timer ved 2 °C - 8 °C før analysen.
Prøver, der opbevares i længere tid (op til 6 måneder), bør kun fryses én gang ved -20 °C før analysen.
Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.
PROTOKOL
【Reagensforberedelse】
1. Alle reagenser skal tages ud af køleskabet og vende tilbage til stuetemperatur før brug
(20° til 25°C). Gem alle reagenser i køleskabet straks efter brug.
2. Alle prøver og kontroller skal vortexes før brug.
3. Forberedelse af hACE2-HRP-opløsning: Fortynd hACE2-HRP-koncentrat i et fortyndingsforhold på 1:51 med Fortynding
Buffer. Fortynd f.eks. 100 μL hACE2-HRP-koncentrat med 5,0mL HRP-fortyndingsbuffer for at
lave en hACE2-HRP-opløsning.
4. Forberedelse af 1× vaskeopløsning: Fortynd 20× vaskeopløsningen med deioniseret eller destilleret vand med en
volumenforhold på 1:19. Fortynd f.eks. 20 mL 20× vaskeopløsning med 380 mL deioniseret eller
destilleret vand til 400 ml 1× vaskeopløsning.
【Testprocedure】
1. I separate rør, alikvoter 120μL af den forberedte hACE2-HRP-opløsning.
2. Tilsæt 6 μL kalibratorer, ukendte prøver, kvalitetskontroller i hvert rør og bland godt.
3. Overfør 100μL af hver blanding fremstillet i trin 2 til tilsvarende mikropladebrønde iht.
til foruddesignet testkonfiguration.
3. Dæk pladen med Plade Sealer og inkuber ved 37°C i 30 minutter.
4. Fjern pladeforsegleren, og vask pladen med ca. 300 μL 1× vaskeopløsning pr. brønd i fire gange.
5. Bank pladen på køkkenrulle for at fjerne resterende væske i brøndene efter vasketrinene.
6. Tilsæt 100 μL TMB-opløsning til hver brønd, og inkuber pladen i mørke ved 20 - 25°C i 20 minutter.
7. Tilsæt 50 μL stopopløsning til hver brønd for at stoppe reaktionen.
8. Aflæs absorbansen i mikropladelæseren ved 450 nm inden for 10 minutter (630 nm som tilbehør er
anbefales for ydeevne med højere præcision).