Pecyn Canfod Gwrthgyrff Niwtraleiddio SARS-CoV-2 (ELISA)
【EGWYDDOR】
Mae Pecyn Canfod Gwrthgyrff Niwtraleiddio SARS-CoV-2 yn seiliedig ar fethodoleg gystadleuol ELISA.
Gan ddefnyddio parth rhwymo derbynyddion puro (RBD), protein o'r protein pigyn firaol (S) a'r gell lletyol
derbynnydd ACE2, mae'r prawf hwn wedi'i gynllunio i ddynwared y rhyngweithio niwtraleiddio firws-westeiwr.
Mae calibratwyr, Rheolaethau Ansawdd, a samplau serwm neu blasma yn cael eu cymysgu'n dda yn unigol wrth wanhau
byffer sy'n cynnwys cyfuniad hACE2-HRP wedi'i ddosbarthu mewn tiwbiau bach.Yna trosglwyddir y cymysgeddau i mewn
y ffynhonnau microplate sy'n cynnwys darn RBD ailgyfunol SARS-CoV-2 (RBD) ansymudol ar gyfer
deor.Yn ystod y cyfnod magu 30 munud, mae'r gwrthgorff penodol RBD yn y calibradu, QC a
bydd samplau yn cystadlu â'r hACE2-HRP ar gyfer rhwymo penodol yr RBD ansymudol yn y ffynhonnau.Wedi
y deoriad, mae'r ffynhonnau'n cael eu golchi 4 gwaith i gael gwared â chyfuniad hACE2-HRP heb ei rwymo.Ateb o
Yna caiff TMB ei ychwanegu a'i ddeor am 20 munud ar dymheredd ystafell, gan arwain at ddatblygiad a
lliw glas.Mae'r datblygiad lliw yn cael ei atal trwy ychwanegu 1N HCl, ac mae'r amsugnedd
wedi'i fesur yn sbectroffotometrig ar 450 nm.Mae dwyster y lliw a ffurfiwyd yn gymesur â'r
faint o ensym sy'n bresennol, ac mae'n gysylltiedig yn wrthdro â faint o safonau a assay yn yr un modd.
O gymharu â'r gromlin graddnodi a ffurfiwyd gan y calibradu a ddarperir, mae crynodiad
yna cyfrifir niwtraleiddio gwrthgyrff yn y sampl anhysbys.
【DEUNYDDIAU ANGENRHEIDIOL OND HEB EI DDARPARU】
1. Dŵr distyll neu wedi'i ddad-ïoneiddio
2. pibedau manwl gywir: 10μL, 100μL,200μL ac 1 mL
3. Awgrymiadau pibed tafladwy
4. Darllenydd microplate sy'n gallu darllen amsugnedd ar 450nm.
5. Papur amsugnol
6. Papur graff
7. Cymysgydd vortex neu gyfwerth
【CASGLU A STORIO SPECIMEN】
1. Gellir defnyddio samplau Serwm a Plasma a gasglwyd mewn tiwbiau sy'n cynnwys K2-EDTA ar gyfer y pecyn hwn.
2. Dylid capio sbesimenau a gellir eu storio am hyd at 48 awr ar 2 °C - 8 °C cyn eu profi.
Dim ond unwaith y dylid rhewi sbesimenau a gedwir am amser hirach (hyd at 6 mis) ar -20 °C cyn profi.
Osgoi cylchoedd rhewi-dadmer dro ar ôl tro.
PROTOCOL
【Paratoi Adweithydd】
1. Rhaid tynnu pob adweithydd allan o'r oergell a'i ganiatáu i ddychwelyd i dymheredd yr ystafell cyn ei ddefnyddio
(20° i 25°C).Arbedwch yr holl adweithyddion yn yr oergell yn brydlon ar ôl eu defnyddio.
2. Dylid vortexed pob sampl a rheolyddion cyn eu defnyddio.
3. Paratoi Ateb hACE2-HRP: gwanhau dwysfwyd hACE2-HRP ar gymhareb gwanhau 1: 51 gyda gwanhau
byffer.Er enghraifft, gwanwch 100 μL o ddwysfwyd hACE2-HRP gyda 5.0mL o glustogfa gwanhau HRP i
gwneud datrysiad hACE2-HRP.
4. 1 × Paratoi Ateb Golchi: Gwanhau'r Ateb Golchi 20 × gyda dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio neu wedi'i ddistyllu â
cymhareb cyfaint o 1:19.Er enghraifft, gwanwch 20 mL o 20 × Ateb Golchi gyda 380 mL o ddadionized neu
dŵr distyll i wneud 400 ml o 1 × Ateb Golchi.
【Gweithdrefn Prawf】
1. Mewn tiwbiau ar wahân, aliquot 120μL o'r Datrysiad hACE2-HRP a baratowyd.
2. Ychwanegu 6 μL o galibradu, samplau anhysbys, rheolaethau ansawdd ym mhob tiwb a chymysgu'n dda.
3. Trosglwyddwch 100μL o bob cymysgedd a baratowyd yn y cam 2 i ffynhonnau microplate cyfatebol yn ôl
i ffurfweddiad prawf wedi'i gynllunio ymlaen llaw.
3. Gorchuddiwch y plât gyda Plate Sealer a deorwch ar 37°C am 30 munud.
4. Tynnwch y Seliwr Plât a golchwch y plât gyda thua 300 μL o 1 × Ateb Golchi fesul ffynnon bedair gwaith.
5. Tapiwch y plât ar dywel papur i gael gwared â hylif gweddilliol yn y ffynhonnau ar ôl golchi camau.
6. Ychwanegwch 100 μL o TMB Solution at bob ffynnon a deorwch y plât yn y tywyllwch ar 20 - 25°C am 20 munud.
7. Ychwanegwch 50 μL o Stop Ateb at bob ffynnon i atal yr adwaith.
8. Darllenwch yr amsugnedd mewn darllenydd microplate ar 450 nm o fewn 10 munud (630nm fel affeithiwr yw
Argymhellir ar gyfer perfformiad manylder uwch).
