SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit (ELISA)
【ZÁSADA】
SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit je založena na konkurenční metodice ELISA.
Použití purifikované receptorové vazebné domény (RBD), proteinu z virového spike (S) proteinu a hostitelské buňky
receptor ACE2, je tento test navržen tak, aby napodoboval neutralizační interakci virus-hostitel.
Kalibrátory, kontroly kvality a vzorky séra nebo plazmy se jednotlivě dobře promíchají v ředění
pufr obsahující hACE2-HRP konjugát alikvotní v malých zkumavkách.Poté se směsi převedou dovnitř
jamky mikrodestičky obsahující imobilizovaný rekombinantní fragment SARS-CoV-2 RBD (RBD) pro
inkubace.Během 30minutové inkubace se RBD specifická protilátka v kalibrátorech, QC a
vzorky budou soutěžit s hACE2-HRP o specifickou vazbu RBD imobilizovaného v jamkách.Po
po inkubaci se jamky 4krát promyjí, aby se odstranil nenavázaný konjugát hACE2-HRP.Řešením
Potom se přidá TMB a inkubuje se 20 minut při teplotě místnosti, což vede k vývoji a
modrá barva.Vyvíjení barvy se zastaví přidáním 1N HC1 a absorbance je
měřeno spektrofotometricky při 450 nm.Intenzita vytvořené barvy je úměrná
množství přítomného enzymu a je nepřímo úměrné množství standardů testovaných stejným způsobem.
Porovnáním s kalibrační křivkou vytvořenou dodanými kalibrátory byla zjištěna koncentrace
pak se vypočítají neutralizační protilátky v neznámém vzorku.
【MATERIÁLY POTŘEBNÉ, ALE NEDODÁVANÉ】
1. Destilovaná nebo deionizovaná voda
2. Přesné pipety: 10μL, 100μL, 200μL a 1 mL
3. Jednorázové špičky pipet
4. Čtečka mikrotitračních destiček schopná odečítat absorbanci při 450 nm.
5. Savý papír
6. Grafický papír
7. Vortexový mixér nebo ekvivalent
【ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU】
1. Pro tuto soupravu lze použít vzorky séra a plazmy odebrané do zkumavek obsahujících K2-EDTA.
2. Vzorky by měly být uzavřeny a před testováním mohou být skladovány po dobu až 48 hodin při teplotě 2 °C - 8 °C.
Vzorky uchovávané po delší dobu (až 6 měsíců) by měly být před analýzou zmrazeny pouze jednou na -20 °C.
Vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování.
PROTOKOL
【Příprava činidla】
1. Všechny reagencie musí být před použitím vyjmuty z chladničky a ponechány vytemperovat na pokojovou teplotu
(20 až 25 °C).Všechny reagencie ihned po použití uložte do chladničky.
2. Všechny vzorky a kontroly by měly být před použitím promíchány na vortexu.
3. Příprava roztoku hACE2-HRP: Zřeďte koncentrát hACE2-HRP v poměru ředění 1:51 s ředěním
Buffer.Například zřeďte 100 μl koncentrátu hACE2-HRP s 5,0 ml ředicího pufru HRP, aby
připravte roztok hACE2-HRP.
4. Příprava 1× promývacího roztoku: Zřeďte 20× promývací roztok deionizovanou nebo destilovanou vodou
objemový poměr 1:19.Například zřeďte 20 ml 20× promývacího roztoku 380 ml deionizovaného popř.
destilovanou vodou, aby se vyrobilo 400 ml 1× promývacího roztoku.
【Testovací postup】
1. Do samostatných zkumavek alikvotně nalijte 120 μl připraveného roztoku hACE2-HRP.
2. Do každé zkumavky přidejte 6 μl kalibrátorů, neznámé vzorky, kontroly kvality a dobře promíchejte.
3. Přeneste 100 μl každé směsi připravené v kroku 2 do odpovídajících jamek mikrodestičky podle pokynů
na předem navrženou testovací konfiguraci.
3. Destičku zakryjte těsnicí hmotou a inkubujte při 37 °C po dobu 30 minut.
4. Odstraňte těsnění destiček a čtyřikrát destičku promyjte přibližně 300 μl 1× promývacího roztoku na jamku.
5. Poklepejte destičkou na papírový ručník, abyste odstranili zbytkovou tekutinu v jamkách po krocích promytí.
6. Přidejte 100 μl roztoku TMB do každé jamky a inkubujte destičku ve tmě při 20 - 25 °C po dobu 20 minut.
7. Přidejte 50 μl zastavovacího roztoku do každé jamky k zastavení reakce.
8. Odečtěte absorbanci na čtečce mikrotitračních destiček při 450 nm do 10 minut (630 nm jako příslušenství
doporučeno pro výkon s vyšší přesností).
