Sada detekce protilátek SARS-CoV-2 (ELISA)
„PRINCIP„
Souprava detekce neutralizující protilátka SARS-CoV-2 je založena na konkurenční metodologii ELISA.
Pomocí čištěného vázací domény receptoru (RBD), proteinu z proteinu virového hrotu a hostitelské buňky
Receptor ACE2, tento test je navržen tak, aby napodoboval neutralizující interakci viru-hostitele.
Kalibrátory, kontroly kvality a vzorky séra nebo plazmy jsou jednotlivě smíchány dobře v ředění
vyrovnávací paměť obsahující konjugované alikvoty HACE2-HRP v malých zkumavkách. Pak jsou směsi přeneseny
mikrodestičky obsahující imobilizované rekombinantní fragment SARS-CoV-2 RBD (RBD) pro
inkubace. Během 30minutové inkubace, specifická protilátka RBD v kalibrátorech, QC a
Vzorky budou konkurovat HACE2-HRP o specifické vazbě RBD imobilizované v jamkách. Po
Inkubace, jamky jsou promyty čtyřikrát, aby se odstranila nevázaný konjugát HACE2-HRP. Řešení
TMB je poté přidána a inkubována po dobu 20 minut při teplotě místnosti, což vede k vývoji a
modrá barva. Vývoj barev je zastaven přidáním 1N HCI a absorbance je
měřeno spektrofotometricky při 450 nm. Intenzita vytvořené barvy je úměrná
Množství přítomného enzymu a nepřímo souvisí s množstvím standardů testovaných stejným způsobem.
Pro ve srovnání s kalibrační křivkou vytvořenou poskytnutými kalibrátory, koncentrace
Poté se vypočítá neutralizační protilátky v neznámém vzorku.
„Požadované materiály, ale nejsou poskytovány„
1. destilovaná nebo deionizovaná voda
2. Precision Pipettes: 10 μl, 100 μl, 200 μl a 1 ml
3. Tipy pro jednorázové pipety
4. Čtečka mikrodestiček schopná číst absorbance při 450 nm.
5. Absorpční papír
6. Graf Paper
7. Mixér víru nebo ekvivalent
„Sběr a skladování vzorků„
1. Vzorky séra a plazmy odebrané v zkumavkách obsahujících K2-EDTA lze pro tuto soupravu použít.
2. vzorky by měly být omezeny a mohou být uloženy až 48 hodin při 2 ° C - 8 ° C před testem.
Vzorky držené po delší dobu (až 6 měsíců) by měly být zmrazeny pouze jednou při -20 ° C před testem.
Vyvarujte se opakovaných cyklů zmrazení a rozmrazení.
PROTOKOL
„Příprava činidla„
1. Všechna činidla musí být vyřazena z chlazení a před použitím se ponecháme vrátit na pokojovou teplotu
(20 ° až 25 ° C). Uložte všechna činidla v lednici okamžitě po použití.
2. Všechny vzorky a ovládací prvky by měly být před použitím vortexovány.
3.. HACE2-HRP Příprava roztoku: Zředěný koncentrát HACE2-HRP v poměru ředění 1: 51 s ředěním
Vyrovnávací paměť. Například zřeďte 100 μl koncentrátu HACE2-HRP s 5,0 ml zředěného pufru HRP na
Vytvořte řešení HACE2-HRP.
4. 1 × promývací roztok Příprava: Nařeďte roztok 20 × promytí deionizovanou nebo destilovanou vodou a
poměr objemu 1:19. Například zřeďte 20 ml roztoku 20 × promytí 380 ml deionizovaného nebo
Destilovaná voda za vzniku 400 ml roztoku 1 x promytí.
„Zkušební postup„
1. V samostatných zkumavkách alikvot 120 μl připraveného roztoku HACE2-HRP.
2. Přidejte 6 ul kalibrátorů, neznámých vzorků, kontroly kvality v každé trubici a dobře promíchejte.
3. Přenos 100 μl každé směsi připravené v kroku 2 do odpovídajících mikrodestiček podle
k předurčené konfiguraci testu.
3. Zakryjte desku těsněním desky a inkubujte při 37 ° C po dobu 30 minut.
4. Odstraňte těsnění desky a destičku omyjte přibližně 300 ul 1 x promytého roztoku na čtyřikrát.
5. Klepnutím na desku na papírovém ručníku odstraníte zbytkovou kapalinu v jamkách po promytí.
6. Přidejte do každé jamky 100 ul roztoku TMB a inkubujte destičku ve tmě při 20 - 25 ° C po dobu 20 minut.
7. Přidejte 50 μl roztoku zastavení do každé jamky, abyste zastavili reakci.
8. Přečtěte si absorbance v čtečce mikrodestiček při 450 nm do 10 minut (630 Nm jako příslušenství je
Doporučuje se pro vyšší přesnost).