Kit di rilevazione di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPIU】
U Kit di Rilevazione di Anticorpi Neutralizzanti SARS-CoV-2 hè basatu annantu à a metodulugia ELISA competitiva.
Utilizendu u duminiu di ubligatoriu di u receptore purificatu (RBD), a proteina da a proteina spike virale (S) è a cellula ospiti
u receptore ACE2, sta prova hè pensata per imite l'interazzione neutralizzante virus-host.
Calibratori, cuntrolli di qualità è campioni di serum o plasma sò mischiati individualmente bè in diluzione
buffer contenente hACE2-HRP conjugate aliquoted in small tubes.Allora i mischii sò trasferiti
i pozzetti di micropiastra chì cuntenenu frammenti RBD SARS-CoV-2 ricombinanti immobilizzati (RBD) per
incubazione.Durante l'incubazione di 30 minuti, l'anticorpu specificu RBD in i calibratori, QC è
i campioni cumpeteranu cù l'hACE2-HRP per ubligatoriu specifichi di u RBD immobilizzatu in i pozzi.Dopu
l'incubazione, i pozzu sò lavati 4 volte per caccià u conjugate hACE2-HRP unbound.Una suluzione di
TMB hè dopu aghjuntu è incubated per 20 minuti à a temperatura di l'ambienti, risultatu in u sviluppu di a
culore turchinu.U sviluppu di u culore hè firmatu cù l'aghjunzione di 1N HCl, è l'assorbanza hè
misurata spettrofotometricamente a 450 nm.L'intensità di u culore furmatu hè proporzionale à u
quantità di enzima presente, è hè inversamente ligata à a quantità di standard assayed in u listessu modu.
Per mezu di paraguni cù a curva di calibrazione formata da i calibratori furniti, a cuncentrazione di
L'anticorpi neutralizzanti in u campionu scunnisciutu hè dunque calculatu.
【MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI】
1. Acqua distillata o deionizzata
2. Pipette di precisione: 10μL, 100μL, 200μL è 1 ml
3. Puntali di pipette dispunibuli
4. Lettore microplate capaci di leghje assorbanza à 450nm.
5. Carta assorbente
6. Carta millimetrata
7. Vortex mixer o equivalente
【RACCOLTA E CONSERVAZIONE DI SPECIMEN】
1. I campioni di Serum è Plasma raccolti in tubi chì cuntenenu K2-EDTA ponu esse usatu per questu kit.
2. Specimens deve esse capped è pò esse guardatu finu à 48 ore à 2 ° C - 8 ° C prima di assaying.
I campioni tenuti per un tempu più longu (finu à 6 mesi) deve esse congelatu solu una volta à -20 ° C prima di l'analisi.
Evite i cicli ripetuti di congelazione-discongelu.
PROTOCOLLU
【Preparazione di reagenti】
1. Tutti i reagenti deve esse eliminati da a refrigerazione è permettenu di vultà à a temperatura di l'ambienti prima di l'usu
(20 à 25 °C).Salvà tutti i reagenti in u frigorifero subitu dopu l'usu.
2. Tutti i campioni è i cuntrolli deve esse vortexed prima di usu.
3. Preparazione di Soluzione hACE2-HRP: Dilute u concentratu hACE2-HRP à 1: 51 ratio di diluzione cù Dilution
Buffer.Per esempiu, diluisce 100 μL di concentratu hACE2-HRP cù 5,0 ml di tampone di diluzione HRP per
fà una suluzione hACE2-HRP.
4. Preparazione di a Soluzione di Lavatura 1×: Diluite a Soluzione di Lavaggio 20× cù acqua deionizzata o distillata cù un
rapportu di volume di 1:19.Per esempiu, diluite 20 mL di Soluzione di Lavaggio 20× cù 380 mL di Deionized o
acqua distillata per fà 400 mL di 1× Soluzione di Lavà.
【Prucedura di prova】
1. In tubi separati, aliquot 120μL di a Soluzione hACE2-HRP preparata.
2. Aghjunghjite 6 μL di calibrators, campioni scunnisciuti, cuntrolli di qualità in ogni tubu è mischjà bè.
3. Trasferisce 100μL di ogni mistura preparata in u passu 2 in i pozzi di microplate currispundenti secondu
à a cunfigurazione di prova predefinita.
3. Coperta a piastra cù Plate Sealer è incubate à 37 ° C per 30 minuti.
4. Eliminate u Plate Sealer è lavate a piastra cù circa 300 μL di 1× Wash Solution per pozzu per quattru volte.
5. Tap the plate on paper towel per sguassà u liquidu residuale in i pozzi dopu à i passi di lavare.
6. Aghjunghjite 100 μL di Soluzione TMB à ogni pozzu è incubate a piastra in u scuru à 20 - 25 ° C per 20 minuti.
7. Aghjunghjite 50 μL di Stop Solution à ogni pozzu per piantà a reazione.
8. Leghjite l'assorbanza in u lettore di microplate à 450 nm in 10 minuti (630nm cum'è accessori hè
consigliata per prestazioni di precisione più elevate).
