Kit de detecció d'anticossos neutralitzants SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIPI】
El kit de detecció d'anticossos neutralitzants SARS-CoV-2 es basa en la metodologia ELISA competitiva.
Utilitzant el domini d'unió al receptor purificat (RBD), la proteïna de la proteïna de l'espiga viral (S) i la cèl·lula hoste
receptor ACE2, aquesta prova està dissenyada per imitar la interacció neutralitzant virus-hoste.
Els calibradors, els controls de qualitat i les mostres de sèrum o plasma es barregen bé individualment en dilució
tampó que conté el conjugat hACE2-HRP en alíquotes en petits tubs. A continuació, es transfereixen les mescles
els pous de microplaques que contenen el fragment RBD SARS-CoV-2 recombinant immobilitzat (RBD) per
incubació. Durant la incubació de 30 minuts, l'anticòs específic RBD als calibradors, QC i
les mostres competiran amb l'hACE2-HRP per unir específicament el RBD immobilitzat als pous. Després
a la incubació, els pous es renten 4 vegades per eliminar el conjugat hACE2-HRP no lligat. Una solució de
Després s'afegeix TMB i s'incuba durant 20 minuts a temperatura ambient, donant lloc al desenvolupament d'a
color blau. El desenvolupament del color s'atura amb l'addició de HCl 1N, i l'absorbància ho és
mesura espectrofotomètricament a 450 nm. La intensitat del color format és proporcional a la
quantitat d'enzim present i està inversament relacionada amb la quantitat d'estàndards analitzats de la mateixa manera.
Mitjançant la comparació amb la corba de calibratge formada pels calibradors proporcionats, la concentració de
A continuació, es calculen els anticossos neutralitzants de la mostra desconeguda.
【MATERIALS NECESSARIS PERÒ NO PROPORCIONATS】
1. Aigua destil·lada o desionitzada
2. Pipetes de precisió: 10μL, 100μL, 200μL i 1 ml
3. Puntes de pipeta d'un sol ús
4. Lector de microplaques capaç de llegir absorbància a 450 nm.
5. Paper absorbent
6. Paper quadriculat
7. Mesclador vortex o equivalent
【RECOLLIDA I EMMAGATZEMATGE DE MOSTRES】
1. Per a aquest kit es poden utilitzar mostres de sèrum i plasma recollides en tubs que contenen K2-EDTA.
2. Les mostres s'han de tapar i es poden emmagatzemar fins a 48 hores a 2 °C - 8 °C abans de l'anàlisi.
Les mostres conservades durant més temps (fins a 6 mesos) només s'han de congelar una vegada a -20 °C abans de l'assaig.
Eviteu cicles de congelació-descongelació repetits.
PROTOCOL
【Preparació de reactius】
1. Tots els reactius s'han de treure de la refrigeració i deixar-los tornar a temperatura ambient abans d'utilitzar-los
(20 a 25 °C). Deseu tots els reactius a la nevera immediatament després de l'ús.
2. Totes les mostres i controls s'han de vortexar abans d'utilitzar-los.
3. Preparació de la solució hACE2-HRP: dilueix el concentrat d'hACE2-HRP a una proporció de dilució 1:51 amb Dilució
Buffer. Per exemple, diluïu 100 μL de concentrat d'hACE2-HRP amb 5,0 ml de tampó de dilució HRP per
fer una solució hACE2-HRP.
4. Preparació de la solució de rentat 1×: dilueix la solució de rentat 20× amb aigua desionitzada o destil·lada amb un
relació de volum d'1:19. Per exemple, diluïu 20 ml de solució de rentat 20× amb 380 ml de solució desionitzada o
aigua destil·lada per fer 400 ml de solució de rentat 1×.
【Procediment de prova】
1. En tubs separats, una alícuota de 120 μL de la solució hACE2-HRP preparada.
2. Afegiu 6 μL de calibradors, mostres desconegudes, controls de qualitat a cada tub i barregeu bé.
3. Transferiu 100 μL de cada mescla preparada al pas 2 als pous de microplaques corresponents segons
a la configuració de prova predissenyada.
3. Cobrir la placa amb Plate Sealer i incubar a 37 °C durant 30 minuts.
4. Traieu el segellador de plaques i renteu-la amb aproximadament 300 μL de solució de rentat 1× per pou quatre vegades.
5. Toqueu la placa amb una tovallola de paper per eliminar el líquid residual dels pous després dels passos de rentat.
6. Afegiu 100 μL de Solució TMB a cada pou i incubeu la placa a la foscor a 20 - 25°C durant 20 minuts.
7. Afegiu 50 μL de Solució Stop a cada pou per aturar la reacció.
8. Llegiu l'absorbància al lector de microplaques a 450 nm en 10 minuts (630 nm com a accessori és
recomanat per a un rendiment de major precisió).