Kit de detecció d’anticossos neutralitzant SARS-COV-2 (ELISA)
【Principi】
El kit de detecció d’anticossos neutralitzant SARS-CoV-2 es basa en la metodologia ELISA competitiva.
Utilitzant domini d’unió del receptor purificat (RBD), proteïna de la proteïna (s) espiga viral i la cèl·lula hoste
Receptor ACE2, aquesta prova està dissenyada per imitar la interacció neutralitzadora-host virus.
Els calibradors, els controls de qualitat i les mostres de sèrum o plasma es barregen bé individualment en dilució
tampó que conté conjugat HACE2-HRP aliquicat en tubs petits. A continuació, les barreges es transfereixen a
els pous de microplaques que contenen fragment recombinant immobilitzat SARS-CoV-2 RBD (RBD) per a
incubació. Durant la incubació de 30 minuts, l'anticòs específic de RBD als calibradors, QC i
Les mostres competiran amb el HACE2-HRP per a la unió específica de la RBD immobilitzada als pous. Després
La incubació, els pous es renten 4 vegades per eliminar el conjugat HACE2-HRP no vinculat. Una solució de
A continuació, s’afegeix i s’incuba TMB durant 20 minuts a temperatura ambient, donant lloc al desenvolupament d’un
Color blau. El desenvolupament del color s’atura amb l’addició d’1N HCl i l’absorbància és
mesurat espectrofotomètricament a 450 nm. La intensitat del color format és proporcional a la
La quantitat d’enzim present i està inversament relacionada amb la quantitat d’estàndards analitzats de la mateixa manera.
Mitjançant la comparació amb la corba de calibració formada pels calibradors proporcionats, la concentració de
A continuació, es calcula els anticossos neutralitzadors de la mostra desconeguda.
【Materials necessaris però no proporcionats】
1. Aigua destil·lada o desionitzada
2 pipetes de precisió: 10 μl, 100 μl, 200 µl i 1 ml
3. Consells de pipeta d’un sol ús
4. Lector de microplaques capaç de llegir l’absorbància a 450 Nm.
5. Paper absorbent
6. Paper gràfic
7. Mesclador de vòrtex o equivalent
【Recollida i emmagatzematge de exemplars】
1. Les mostres de sèrum i plasma recollides en tubs que contenen K2-EDTA es poden utilitzar per a aquest kit.
2. Els exemplars s’han de tapar i es poden emmagatzemar fins a 48 hores a 2 ° C - 8 ° C abans de l’assaig.
Els exemplars mantinguts durant més temps (fins a 6 mesos) s’han de congelar només una vegada a -20 ° C abans de l’assaig.
Eviteu els cicles de congelació repetits.
Protocol
【Preparació del reactiu】
1. Tots els reactius han de ser extrets de la refrigeració i deixar -los tornar a la temperatura ambient abans de l’ús
(De 20 a 25 ° C). Deseu tots els reactius a la nevera immediatament després de l'ús.
2. Totes les mostres i els controls s’han de vortejar abans de l’ús.
3. Preparació de solucions HACE2-HRP: Diluir concentrat HACE2-HRP a la relació de dilució 1: 51 amb dilució
Buffer. Per exemple, diluir 100 µl de concentrat HACE2-HRP amb 5,0 ml de tampó de dilució de HRP
Feu una solució HACE2-HRP.
4.
Ràtio de volum de 1:19. Per exemple, diluïu 20 ml de solució de 20 × amb 380 ml de desionitzada o
Aigua destil·lada per fer 400 ml de solució de rentat 1 ×.
【Procediment de prova】
1. En tubs separats, Aliquot 120 µl de la solució HACE2-HRP preparada.
2 Afegiu 6 µl de calibradors, mostres desconegudes, controls de qualitat a cada tub i barregeu -ho bé.
3. Transferiu 100 μl de cada barreja preparada al pas 2 a pous de microplaques corresponents segons
a la configuració de prova predisignada.
3. Cobriu la placa amb segellador de plaques i incubeu a 37 ° C durant 30 minuts.
4. Retireu el segellador de la placa i renteu la placa amb aproximadament 300 µl de solució de rentat 1 × per pou per a quatre vegades.
5. Toqueu la placa sobre la tovallola de paper per eliminar el líquid residual als pous després de rentar els passos.
6 Afegiu 100 µl de solució TMB a cada pou i incubeu la placa a fosc a 20 a 25 ° C durant 20 minuts.
7. Afegiu 50 µl de solució d’aturada a cada pou per aturar la reacció.
8. Llegiu l'absorbància del lector de microplaques a 450 nm en 10 minuts (630nm com a accessori
Recomanat per a un rendiment de precisió superior).