Komplet za detekciju neutralizirajućih antitijela SARS-CoV-2 (ELISA)
【PRINCIP】
Komplet za detekciju neutralizirajućih antitijela SARS-CoV-2 baziran je na kompetitivnoj ELISA metodologiji.
Korištenjem pročišćene domene za vezivanje receptora (RBD), proteina iz proteina virusnog šiljka (S) i ćelije domaćina
receptora ACE2, ovaj test je dizajniran da oponaša interakciju neutralizacije virusa i domaćina.
Kalibratori, kontrole kvaliteta i uzorci seruma ili plazme se pojedinačno dobro miješaju u razrjeđenju
pufer koji sadrži hACE2-HRP konjugat alikvot u malim epruvetama. Zatim se smjese prebacuju unutra
jažice mikroploče koje sadrže imobilizirani rekombinantni SARS-CoV-2 RBD fragment (RBD) za
inkubacija. Tokom 30-minutne inkubacije, RBD specifično antitijelo u kalibratorima, QC i
uzorci će se takmičiti sa hACE2-HRP za specifično vezivanje RBD-a imobilisanog u bunarima. Poslije
nakon inkubacije, jažice se isperu 4 puta da bi se uklonio nevezani hACE2-HRP konjugat. Rješenje za
Zatim se dodaje TMB i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi, što rezultira razvojem a
plava boja. Razvoj boje se zaustavlja dodatkom 1N HCl, a apsorbancija je
izmjereno spektrofotometrijski na 450 nm. Intenzitet formirane boje proporcionalan je
količina prisutnog enzima, i obrnuto je povezana sa količinom standarda koji se ispituju na isti način.
Poređenjem sa kalibracionom krivuljom koju su formirali obezbeđeni kalibratori, koncentracija od
neutralizirajuća antitijela u nepoznatom uzorku se zatim izračunavaju.
【POTREBNI MATERIJALI ALI NIJE OBEZBEĐENI】
1. Destilovana ili dejonizovana voda
2. Precizne pipete: 10μL, 100μL, 200μL i 1 mL
3. Jednokratni vrhovi za pipete
4. Čitač mikroploča koji može očitati apsorbanciju na 450 nm.
5. Upijajući papir
6. Gramofonski papir
7. Vrtložni mikser ili ekvivalentan
【PRIKUPLJANJE I SKLADIŠTENJE UZORAKA】
1. Uzorci seruma i plazme prikupljeni u epruvetama koje sadrže K2-EDTA mogu se koristiti za ovaj komplet.
2. Uzorci moraju biti zatvoreni i mogu se čuvati do 48 sati na 2 °C - 8 °C prije analize.
Uzorke koji se drže duže (do 6 mjeseci) treba zamrznuti samo jednom na -20 °C prije analize.
Izbjegavajte ponovljene cikluse zamrzavanja-odmrzavanja.
PROTOKOL
【Priprema reagensa】
1. Svi reagensi se moraju izvaditi iz hladnjaka i ostaviti da se vrate na sobnu temperaturu prije upotrebe
(20° do 25°C). Sve reagense čuvajte u frižideru odmah nakon upotrebe.
2. Sve uzorke i kontrole treba promiješati prije upotrebe.
3. Priprema otopine hACE2-HRP: Razrijedite hACE2-HRP koncentrat u omjeru razrjeđenja 1:51 s razrjeđivanjem
Buffer. Na primjer, razrijedite 100 μL hACE2-HRP koncentrata sa 5,0 mL HRP pufera za razrjeđivanje kako biste
napravite hACE2-HRP rješenje.
4. Priprema 1× otopine za pranje: Razrijedite 20× otopinu za pranje dejoniziranom ili destilovanom vodom pomoću
omjer volumena 1:19. Na primjer, razrijedite 20 mL 20× otopine za pranje sa 380 mL deioniziranog ili
destilovanu vodu da napravite 400 mL 1× rastvora za pranje.
【Procedura testiranja】
1. U odvojenim epruvetama, alikvot od 120 μL pripremljenog rastvora hACE2-HRP.
2. Dodajte 6 μL kalibratora, nepoznatih uzoraka, kontrole kvaliteta u svaku epruvetu i dobro promiješajte.
3. Prenesite 100 μL svake mješavine pripremljene u koraku 2 u odgovarajuće jažice mikroploče prema
na unaprijed dizajniranu test konfiguraciju.
3. Pokrijte ploču sa Plate Sealer-om i inkubirajte na 37°C 30 minuta.
4. Uklonite zaptivač za ploče i operite ploču sa približno 300 μL 1× rastvora za pranje po otvoru četiri puta.
5. Kucnite tanjir o papirni ubrus da biste uklonili ostatke tečnosti u jamicama nakon koraka pranja.
6. Dodajte 100 μL rastvora TMB u svaku jažicu i inkubirajte ploču u mraku na 20 - 25°C 20 minuta.
7. Dodajte 50 μL Stop rastvora u svaku jažicu da zaustavite reakciju.
8. Očitajte apsorbanciju u čitaču mikropločica na 450 nm u roku od 10 minuta (630 nm kao dodatak
preporučuje se za veću preciznost).