SARS-CoV-2 নিউট্রালাইজিং অ্যান্টিবডি ডিটেকশন কিট (ELISA)
【নীতি】
SARS-CoV-2 নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ কিট প্রতিযোগিতামূলক ELISA পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে।
বিশুদ্ধ রিসেপ্টর বাইন্ডিং ডোমেন (RBD), ভাইরাল স্পাইক (S) প্রোটিন এবং হোস্ট সেল থেকে প্রোটিন ব্যবহার করে
রিসেপ্টর ACE2, এই পরীক্ষাটি ভাইরাস-হোস্ট নিরপেক্ষ মিথস্ক্রিয়া অনুকরণ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে।
ক্যালিব্রেটর, কোয়ালিটি কন্ট্রোল এবং সিরাম বা প্লাজমা নমুনাগুলি পৃথকভাবে পাতলা অবস্থায় ভালভাবে মিশ্রিত হয়
HACE2-HRP কনজুগেট ধারণকারী বাফার ছোট টিউবে অ্যালিকোটেড।তারপরে মিশ্রণগুলি স্থানান্তরিত হয়
মাইক্রোপ্লেট কূপ যাতে অচল রিকম্বিন্যান্ট SARS-CoV-2 RBD ফ্র্যাগমেন্ট (RBD) থাকে
ইনকিউবেশন30-মিনিটের ইনকিউবেশনের সময়, ক্যালিব্রেটরগুলিতে RBD নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি, QC এবং
নমুনাগুলি কূপের মধ্যে স্থির RBD-কে নির্দিষ্ট বাঁধার জন্য hACE2-HRP-এর সাথে প্রতিদ্বন্দ্বিতা করবে।পরে
ইনকিউবেশন, কূপগুলি 4 বার ধৌত করা হয় যাতে সীমাহীন hACE2-HRP কনজুগেট অপসারণ করা হয়।এর একটি সমাধান
তারপরে টিএমবি যোগ করা হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়, যার ফলে a এর বিকাশ ঘটে
নীল রঙ.1N HCl যোগ করার সাথে রঙের বিকাশ বন্ধ হয়ে যায় এবং শোষণ হয়
450 এনএম এ স্পেকট্রোফটোমেট্রিকভাবে পরিমাপ করা হয়।গঠিত রঙের তীব্রতা সমানুপাতিক
এনজাইমের পরিমাণ বর্তমান, এবং একইভাবে পরিমাপ করা মানগুলির পরিমাণের সাথে বিপরীতভাবে সম্পর্কিত।
প্রদত্ত ক্যালিব্রেটর দ্বারা গঠিত ক্রমাঙ্কন বক্ররেখার সাথে তুলনা করার মাধ্যমে, এর ঘনত্ব
অজানা নমুনায় নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি তারপর গণনা করা হয়।
【উপকরণ প্রয়োজন কিন্তু প্রদান করা হয় না】
1. পাতিত বা deionized জল
2. যথার্থ পাইপেট: 10μL, 100μL, 200μL এবং 1 মিলি
3. নিষ্পত্তিযোগ্য পাইপেট টিপস
4. মাইক্রোপ্লেট রিডার 450nm এ শোষণ পড়তে সক্ষম।
5. শোষক কাগজ
6. গ্রাফ পেপার
7. ঘূর্ণি মিশুক বা সমতুল্য
【নমুনা সংগ্রহ এবং সঞ্চয়】
1. K2-EDTA ধারণকারী টিউবে সংগৃহীত সিরাম এবং প্লাজমা নমুনা এই কিটের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
2. নমুনাগুলিকে ক্যাপ করা উচিত এবং পরীক্ষা করার আগে 2 °C - 8 °C তাপমাত্রায় 48 ঘন্টা পর্যন্ত সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
দীর্ঘ সময়ের জন্য (6 মাস পর্যন্ত) রাখা নমুনাগুলি পরীক্ষা করার আগে শুধুমাত্র একবার -20 ডিগ্রি সেলসিয়াসে হিমায়িত করা উচিত।
বারবার ফ্রিজ-থাও চক্র এড়িয়ে চলুন।
প্রোটোকল
【বিকারক প্রস্তুতি】
1. সমস্ত রিএজেন্ট অবশ্যই হিমায়ন থেকে বের করে নিতে হবে এবং ব্যবহারের আগে ঘরের তাপমাত্রায় ফিরে যেতে হবে
(20° থেকে 25°C)।ব্যবহারের পরে অবিলম্বে রেফ্রিজারেটরে সমস্ত রিএজেন্ট সংরক্ষণ করুন।
2. সমস্ত নমুনা এবং নিয়ন্ত্রণ ব্যবহারের আগে ঘূর্ণি করা উচিত.
3. hACE2-HRP সলিউশন প্রস্তুতি: hACE2-HRP ঘনত্বকে 1:51 পাতলা করে পাতলা করুন
বাফার।উদাহরণস্বরূপ, 100 μL hACE2-HRP ঘনীভূত করে 5.0mL এইচআরপি ডাইলিউশন বাফারের সাথে পাতলা করুন
একটি hACE2-HRP সমাধান তৈরি করুন।
4. 1× ধোয়ার দ্রবণ প্রস্তুতি: 20× ধোয়ার দ্রবণকে ডিওনাইজড বা পাতিত জল দিয়ে পাতলা করুন
আয়তনের অনুপাত 1:19।উদাহরণস্বরূপ, 20 × ওয়াশ সলিউশনের 20 মিলি ডিওনাইজড বা 380 এমএল দিয়ে পাতলা করুন
পাতিত জল 400 mL 1× ধোয়ার দ্রবণ তৈরি করতে।
【পরীক্ষা পদ্ধতি】
1. পৃথক টিউবে, প্রস্তুত hACE2-HRP সলিউশনের অ্যালিকোট 120μL।
2. প্রতিটি টিউবে 6 μL ক্যালিব্রেটর, অজানা নমুনা, গুণমান নিয়ন্ত্রণ যোগ করুন এবং ভালভাবে মিশ্রিত করুন।
3. ধাপ 2 এ প্রস্তুতকৃত প্রতিটি মিশ্রণের 100μL অনুরূপ মাইক্রোপ্লেট কূপে স্থানান্তর করুন
পূর্বপরিকল্পিত পরীক্ষা কনফিগারেশন.
3. প্লেট সিলার দিয়ে প্লেটটি ঢেকে রাখুন এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।
4. প্লেট সিলারটি সরিয়ে ফেলুন এবং প্লেটটিকে প্রায় 300 μL 1× ওয়াশ সলিউশন প্রতি ভাল করে চারবার ধুয়ে ফেলুন।
5. ধাপ ধোয়ার পরে কূপের অবশিষ্ট তরল অপসারণ করতে কাগজের তোয়ালে প্লেটটি আলতো চাপুন।
6. প্রতিটি কূপে 100 μL টিএমবি সলিউশন যোগ করুন এবং প্লেটটিকে 20 - 25 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য অন্ধকারে সেঁকুন৷
7. প্রতিক্রিয়া বন্ধ করতে প্রতিটি কূপে 50 μL স্টপ সলিউশন যোগ করুন।
8. 10 মিনিটের মধ্যে 450 এনএম-এ মাইক্রোপ্লেট রিডারে শোষণ পড়ুন (আনুষঙ্গিক হিসাবে 630nm হল
উচ্চ নির্ভুলতা কর্মক্ষমতা জন্য সুপারিশ করা হয়)।
