SARS-CoV-2 Комплект за откриване на неутрализиращи антитела (ELISA)
【ПРИНЦИП】
Комплектът за откриване на неутрализиращи антитела на SARS-CoV-2 се основава на конкурентна методология ELISA.
Използване на пречистен рецепторен свързващ домен (RBD), протеин от протеина на вирусния шип (S) и клетката гостоприемник
рецептор ACE2, този тест е предназначен да имитира неутрализиращото взаимодействие вирус-гостоприемник.
Калибратори, контроли за качество и проби от серум или плазма се смесват добре поотделно в разреждането
буфер, съдържащ hACE2-HRP конюгат, разпределен в малки епруветки. След това се прехвърлят смесите
ямките на микроплаката, съдържащи имобилизиран рекомбинантен SARS-CoV-2 RBD фрагмент (RBD) за
инкубация. По време на 30-минутната инкубация, RBD специфичното антитяло в калибраторите, QC и
пробите ще се конкурират с hACE2-HRP за специфично свързване на RBD, имобилизиран в ямките. след
инкубацията, ямките се промиват 4 пъти, за да се отстрани несвързаният hACE2-HRP конюгат. Решение на
След това се добавя TMB и се инкубира в продължение на 20 минути при стайна температура, което води до развитието на a
син цвят. Развитието на цвета се спира с добавянето на 1N HCl, а абсорбцията е
измерено спектрофотометрично при 450 nm. Интензивността на образувания цвят е пропорционална на
количеството на присъстващия ензим и е обратно пропорционално на количеството стандарти, анализирани по същия начин.
Чрез сравнение с калибрационната крива, образувана от предоставените калибратори, концентрацията на
след това се изчисляват неутрализиращи антитела в неизвестната проба.
【НЕОБХОДИМИ МАТЕРИАЛИ, НО НЕ СА ПРЕДОСТАВЕНИ】
1. Дестилирана или дейонизирана вода
2. Прецизни пипети: 10 μL, 100 μL, 200 μL и 1 mL
3. Еднократни накрайници за пипети
4. Четец на микроплаки, способен да отчита абсорбция при 450 nm.
5. Абсорбираща хартия
6. Милиметрова хартия
7. Вихров миксер или еквивалентен
【СЪБИРАНЕ И СЪХРАНЕНИЕ НА ОБРАЗЦИ】
1. За този комплект могат да се използват проби от серум и плазма, събрани в епруветки, съдържащи K2-EDTA.
2. Пробите трябва да бъдат затворени и могат да се съхраняват до 48 часа при 2 °C - 8 °C преди анализ.
Пробите, съхранявани за по-дълго време (до 6 месеца), трябва да бъдат замразени само веднъж при -20 °C преди анализ.
Избягвайте повтарящи се цикли на замразяване-размразяване.
ПРОТОКОЛ
【Подготовка на реагента】
1. Всички реагенти трябва да се извадят от хладилника и да се оставят да достигнат стайна температура преди употреба
(20° до 25°C). Съхранявайте всички реактиви в хладилник веднага след употреба.
2. Всички проби и контроли трябва да се разбъркат на вортекс преди употреба.
3. Приготвяне на разтвор на hACE2-HRP: Разредете концентрата на hACE2-HRP в съотношение на разреждане 1: 51 с Разреждане
Буфер. Например, разредете 100 μL концентрат на hACE2-HRP с 5,0 mL буфер за разреждане на HRP, за да
направете разтвор на hACE2-HRP.
4. Приготвяне на 1× промивен разтвор: Разредете 20× промивен разтвор с дейонизирана или дестилирана вода с
обемно съотношение 1:19. Например, разредете 20 mL от 20 × разтвор за измиване с 380 mL дейонизиран или
дестилирана вода, за да направите 400 mL от 1 × разтвор за измиване.
【Процедура за изпитване】
1. В отделни епруветки, аликвотирайте 120 μL от приготвения разтвор на hACE2-HRP.
2. Добавете 6 μL калибратори, неизвестни проби, контроли за качество във всяка епруветка и разбъркайте добре.
3. Прехвърлете 100 μL от всяка смес, приготвена в стъпка 2, в съответните ямки на микроплака според
към предварително проектирана тестова конфигурация.
3. Покрийте плочата с уплътнител за плочи и инкубирайте при 37°C за 30 минути.
4. Отстранете уплътнителя на плочата и измийте плочата с приблизително 300 μL от 1 × разтвор за промиване на ямка четири пъти.
5. Почукайте плаката върху хартиена кърпа, за да отстраните остатъчната течност в ямките след стъпките на измиване.
6. Добавете 100 μL разтвор на TMB към всяка ямка и инкубирайте плаката на тъмно при 20 - 25°C за 20 минути.
7. Добавете 50 μL стоп разтвор към всяка ямка, за да спрете реакцията.
8. Отчетете абсорбцията в четец на микроплаки при 450 nm в рамките на 10 минути (630 nm като аксесоар е
препоръчва се за по-висока точност).