SARS-COV-2 Неутрализиращ комплект за откриване на антитела (ELISA)
【Принцип】
Комплектът за откриване на антитела SARS-COV-2 се основава на конкурентна методология на ELISA.
Използване на пречистен рецепторно свързващ домен (RBD), протеин от вирусния скок (S) протеин и клетката гостоприемник
Рецептор ACE2, този тест е предназначен да имитира взаимодействието, неутрализиращо вирус-гостоприемник.
Калибраторите, контролът на качеството и серумните или плазмените проби се смесват индивидуално в разреждане
Буфер, съдържащ HACE2-HRP конюгат аликвотиран в малки тръби. След това смесите се прехвърлят в
Микроплакционните кладенци, съдържащи обездвижен рекомбинантен SARS-COV-2 RBD фрагмент (RBD) за
инкубация. По време на 30-минутната инкубация, RBD специфичното антитяло в калибраторите, QC и
Пробите ще се конкурират с HACE2-HRP за специфично свързване на RBD обездвижваните в кладенците. След
Инкубацията, кладенците се промиват 4 пъти, за да се отстрани несвързаният конюгат HACE2-HRP. Решение на
След това TMB се добавя и се инкубира в продължение на 20 минути при стайна температура, което води до разработване на a
Син цвят. Развитието на цветовете се спира с добавянето на 1N HCl, а абсорбцията е
Измерено спектрофотометрично при 450 nm. Интензивността на образувания цвят е пропорционална на
Количеството ензим присъства и е обратно свързано с количеството на стандартите, анализирани по същия начин.
Чрез сравнение с калибрационната крива, образувана от предоставените калибратори, концентрацията на
След това се изчислява неутрализиращите антитела в неизвестната проба.
【Необходими материали, но не са предоставени】
1. Дестилирана или дейонизирана вода
2. Прецизни пипети: 10 μl, 100 μl, 200 μl и 1 ml
3. Съвети за пипета за еднократна употреба
4. четец на микроплаки, способен да чете абсорбцията при 450 nm.
5. Абсорбираща хартия
6. Графична хартия
7. Vortex смесител или еквивалент
【Събиране и съхранение на образци】
1. Серумните и плазмените проби, събрани в епруветки, съдържащи K2-EDTA, могат да се използват за този комплект.
2. Образците трябва да бъдат ограничени и могат да се съхраняват до 48 часа при 2 ° C - 8 ° C преди анализа.
Екземплярите, държани за по -дълго време (до 6 месеца), трябва да бъдат замразени само веднъж при -20 ° C преди анализа.
Избягвайте многократните цикли на замразяване-размразяване.
Протокол
【Подготовка на реагенти】
1. Всички реагенти трябва да се извадят от хладилник и да се оставят да се върнат към стайна температура преди употреба
(20 ° до 25 ° C). Запазете всички реагенти в хладилника незабавно след употреба.
2. Всички проби и контроли трябва да бъдат вихри преди употреба.
3. HACE2-HRP разтвор Приготвяне: Разрешаване на HACE2-HRP концентрат при съотношение на разреждане 1: 51 с разреждане
Буфер. Например, разрежда 100 μl концентрат HACE2-HRP с 5.0ml буфер за разреждане на HRP до
Направете HACE2-HRP решение.
4.
Съотношение на обема от 1:19. Например, разрежда 20 ml 20 × разтвор за промиване с 380 ml дейонизиран или
Дестилирана вода, за да се направи 400 ml разтвор на 1 × измиване.
【Процедура за изпитване】
1. В отделни тръби, аликвота 120 μl от подготвения HACE2-HRP разтвор.
2. Добавете 6 μl калибратори, неизвестни проби, контрол на качеството във всяка епруветка и разбъркайте добре.
3. Прехвърлете 100 μl от всяка смес, приготвена в стъпка 2 в съответните микропластни кладенци съгласно
до предварително проектирана тестова конфигурация.
3. Покрийте плочата с уплътнител на плочата и инкубирайте при 37 ° С за 30 минути.
4. Извадете уплътнителя на плочата и измийте плочата с приблизително 300 μl разтвор на 1 × промиване на добре четири пъти.
5. Докоснете чинията на хартиена кърпа, за да премахнете остатъчната течност в кладенците след етапите на измиване.
6. Добавете 100 μl разтвор на TMB към всяка ямка и инкубирайте плаката в тъмно при 20 - 25 ° С за 20 минути.
7. Добавете 50 μl стоп разтвор към всеки ямка, за да спрете реакцията.
8. Прочетете абсорбцията в четец на микроплаки при 450 nm в рамките на 10 минути (630 nm, тъй като аксесоарът е
Препоръчва се за по -висока прецизна ефективност).