Набор для выяўлення нейтралізуючых антыцелаў да SARS-CoV-2 (ELISA)
【ПРЫНЦЫП】
Набор для выяўлення нейтралізуючых антыцелаў SARS-CoV-2 заснаваны на канкурэнтнай метадалогіі ELISA.
Выкарыстанне вычышчанага дамена звязвання з рэцэптарам (RBD), бялку з віруснага шыпа (S) і клеткі-гаспадара
рэцэптара ACE2, гэты тэст прызначаны для імітацыі нейтралізуючага ўзаемадзеяння віруса і гаспадара.
Калібратары, сродкі кантролю якасці і ўзоры сыроваткі або плазмы індывідуальна добра змешваюцца ў развядзенні
буфер, які змяшчае кан'югат hACE2-HRP, разбіты ў невялікія прабіркі.Затым сумесі перакладаюцца
лункі мікрапланшата, якія змяшчаюць імабілізаваны рэкамбінантны фрагмент RBD SARS-CoV-2 (RBD) для
інкубацыйны.Падчас 30-хвіліннай інкубацыі RBD-спецыфічныя антыцелы ў калібратарах, КК і
ўзоры будуць канкурыраваць з hACE2-HRP за спецыфічнае звязванне RBD, імабілізаванага ў лунках.Пасля
інкубацыі лункі прамываюць 4 разы для выдалення незвязанага кан'югата hACE2-HRP.Рашэнне
Затым дадаюць TMB і інкубуюць 20 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, што прыводзіць да развіцця a
блакітны колер.Развіццё колеру спыняецца з даданнем 1N HCl, і паглынанне
вымяраецца спектрафатаметрычна пры 450 нм.Інтэнсіўнасць фарміруецца прапарцыйная
колькасць прысутнага фермента і знаходзіцца ў зваротнай залежнасці ад колькасці стандартаў, якія аналізуюцца такім жа чынам.
Праз параўнанне з калібравальнай крывой, сфарміраванай забяспечанымі калібратарамі, канцэнтрацыя
затым вылічаюцца нейтралізуючыя антыцелы ў невядомым узоры.
【МАТЭРЫЯЛЫ, ПАТРЭБНЫЯ, АЛЕ НЕ ПАСТАЎЛЯЮЦЦА】
1. Дыстыляваная або дэіянізаваная вада
2. Дакладныя піпеткі: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл і 1 мл
3. Аднаразовыя наканечнікі для піпетак
4. Счытвальнік мікрапланшэтаў, здольны счытваць паглынанне пры 450 нм.
5. Паглынальная папера
6. Міліметровая папера
7. Віхравы міксер або аналагічны
【ЗБОР І ЗАХОЎВАННЕ Ўзораў】
1. Для гэтага набору можна выкарыстоўваць узоры сыроваткі і плазмы, сабраныя ў прабіркі, якія змяшчаюць K2-EDTA.
2. Узоры павінны быць зачынены вечкам і могуць захоўвацца да 48 гадзін пры 2 °C - 8 °C перад аналізам.
Узоры, якія захоўваюцца на працягу больш доўгага часу (да 6 месяцаў), павінны быць замарожаны толькі адзін раз пры -20 °C перад аналізам.
Пазбягайце паўторных цыклаў замарожвання-адтавання.
ПРАТАКОЛ
【Падрыхтоўка рэагентаў】
1. Перад выкарыстаннем усе рэагенты трэба дастаць з халадзільніка і даць ім вярнуцца да пакаёвай тэмпературы
(ад 20° да 25°C).Захоўвайце ўсе рэагенты ў халадзільніку адразу пасля выкарыстання.
2. Усе ўзоры і кантрольныя пробы перад выкарыстаннем неабходна змяшаць.
3. Падрыхтоўка раствора hACE2-HRP: развядзіце канцэнтрат hACE2-HRP у суадносінах развядзення 1: 51 з дапамогай развядзення.
Буфер.Напрыклад, развядзіце 100 мкл канцэнтрату hACE2-HRP 5,0 мл буфера для развядзення HRP, каб
зрабіць раствор hACE2-HRP.
4. Падрыхтоўка 1 × раствора для прамывання: развядзіце 20 × раствор для прамывання дэіянізаванай або дыстыляванай вадой з дапамогай
аб'ёмныя суадносіны 1:19.Напрыклад, развядзіце 20 мл раствора для прамывання 20 × 380 мл дэіянізаванай або
дыстыляванай вады, каб зрабіць 400 мл 1 × раствора для прамывання.
【Працэдура выпрабаванняў】
1. У асобныя прабіркі разбярыце 120 мкл прыгатаванага раствора hACE2-HRP.
2. Дадайце 6 мкл калібратараў, невядомых узораў, кантроляў якасці ў кожную прабірку і добра змяшайце.
3. Перанясіце 100 мкл кожнай сумесі, прыгатаванай на этапе 2, у адпаведныя лункі мікрапланшата ў адпаведнасці з
да загадзя распрацаванай тэставай канфігурацыі.
3. Накрыйце пласціну Plate Sealer і інкубуйце пры 37°C на працягу 30 хвілін.
4. Зніміце герметык для пласціны і прамыйце пласціну прыблізна 300 мкл 1 × раствора для прамывання на лунку чатыры разы.
5. Пастукайце пласцінай па папяровым ручнік, каб выдаліць рэшткі вадкасці ў лунках пасля этапаў прамывання.
6. Дадайце 100 мкл раствора TMB у кожную лунку і інкубуйце пласціну ў цемры пры 20 - 25°C на працягу 20 хвілін.
7. Дадайце 50 мкл стоп-раствора ў кожную лунку, каб спыніць рэакцыю.
8. Прачытайце абсорбцыю ў счытвальніку мікрапланшэтаў пры 450 нм на працягу 10 хвілін (630 нм у якасці дадатку).
рэкамендуецца для больш высокай прадукцыйнасці дакладнасці).
