SARS-COV-2 нейтралізуючы набор для выяўлення антыцелаў (ІФА)
【Прынцып】
Набор SARS-COV-2, які нейтралізуе антыцелы, заснаваны на канкурэнтнай метадалогіі ІФА.
Выкарыстоўваючы вычышчаны дамен звязвання рэцэптараў (RBD), бялок з віруснага шыпа (ы) бялку і клетка гаспадара
Рэцэптар ACE2, гэты тэст прызначаны для імітацыі нейтралізацыі віруса-гаспадара.
Калібратары, кантроль якасці і пробы сыроваткі або плазмы індывідуальна змешваюцца ў развядзенні
Буфер, які змяшчае кан'югат HACE2-HRP, аликвота, у невялікіх труб. Затым сумесі перадаюцца ў
Мікрапласцінкі свідравін, якія змяшчаюць імабілізаваны рэкамбінантны фрагмент RBD SARS-COV-2 (RBD) для
інкубацыя. Падчас 30-хвіліннай інкубацыі, спецыфічнае антыцела RBD у калібратараў, QC і
Узоры будуць канкурыраваць з HACE2-HRP за пэўнае звязванне RBD, замацаваны ў свідравінах. Пасля
Інкубацыя, свідравіны прамываюць 4 разы, каб выдаліць нязвязаны кан'югат HACE2-HRP. Рашэнне
Затым TMB дадаюць і вытрымліваюць на працягу 20 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, што прыводзіць да развіцця a
сіні колер. Развіццё колеру спыняецца з даданнем 1N HCl, і паглынанне ёсць
Вымяраецца спектрафатаметрычна пры 450 нм. Інтэнсіўнасць утворанага колеру прапарцыйная
Колькасць ферментаў прысутнічае і зваротна звязана з колькасцю стандартаў, аналізаваных аднолькава.
У параўнанні з калібровачнай крывой, утворанай прыведзенай калібратарам, канцэнтрацыя
Затым разлічваецца нейтралізацыя антыцелаў у невядомым узоры.
【Неабходныя матэрыялы, але не прадастаўляюцца】
1. Дыстыляваная альбо деионизированная вада
2. Дакладныя піпеткі: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл і 1 мл
3. Аднаразовыя парады піпеткі
4. Чытальнік мікрапласцінак, здольны прачытаць паглынанне на 450 нм.
5. Папяровая папера
6. Графічная папера
7. Вартавы змяшальнік альбо эквівалент
【Калекцыя і захоўванне асобнікаў】
1. Для гэтага камплекта могуць быць выкарыстаны пробы сыроваткі і плазмы, сабраныя ў трубах, якія змяшчаюць K2-EDTA.
2. Узоры павінны быць абмежаваны і могуць захоўвацца да 48 гадзін пры 2 ° С - 8 ° С перад аналізам.
Узоры, якія праводзяцца на працягу больш доўгага часу (да 6 месяцаў), павінны быць замарожаныя толькі адзін раз пры -20 ° С да аналізу.
Пазбягайце паўторных цыклаў замарожвання-адтавання.
Пратакол
【Падрыхтоўка рэагентаў】
1. Усе рэагенты павінны быць вывезены з халадзільніка і дазваляюць вярнуцца да пакаёвай тэмпературы перад выкарыстаннем
(20 ° да 25 ° С). Захавайце ўсе рэагенты ў халадзільніку імгненна пасля выкарыстання.
2. Усе ўзоры і элементы кіравання павінны быць заведзены перад выкарыстаннем.
3. Падрыхтоўка раствора HACE2-HRP: развядзіце канцэнтрат HACE2-HRP пры суадносінах развядзення 1: 51 з развядзеннем
Буфер. Напрыклад, развядзіце 100 мкл канцэнтрату HACE2-HRP з 5,0 мл буфера развядзення HRP да
Зрабіце раствор HACE2-HRP.
4. Падрыхтоўка раствора 1 × мыццё: развядзіце раствор 20 × мыццё деионизированной або дыстыляванай вадой з
Каэфіцыент аб'ёму 1:19. Напрыклад, развядзіце 20 мл раствора 20 × 380 мл деионизированных альбо
Дыстыляваная вада, каб зрабіць 400 мл раствора 1 × мыцця.
【Працэдура выпрабаванняў】
1. У асобных труб, аликвота 120 мкл падрыхтаванага раствора HACE2-HRP.
2. Дадайце 6 мкл калібратараў, невядомыя ўзоры, кантроль якасці ў кожнай трубцы і добра змяшайце.
3. Перакладзеце 100 мкл кожнай сумесі, прыгатаванай на этапе 2, у адпаведныя мікрапласцінкі ў адпаведнасці з
да загадзя распрацаванай канфігурацыі выпрабаванняў.
3. Накрыйце пласціну пласцінай ушчыльняльнікам і вытрымлівайце пры 37 ° С на працягу 30 хвілін.
4. Зніміце ўшчыльняльнік пласціны і прамыйце пласціну прыблізна 300 мкл раствора 1 × мыцця на добра для чатырох разоў.
5. Націсніце на пласціну на папяровым ручніцу, каб выдаліць рэшткавую вадкасць у свідравінах пасля прыступкі мыцця.
6. Дадайце 100 мкл раствора ТМБ у кожную лунку і вытрымлівайце пласціну ў цемры пры 20 - 25 ° С на працягу 20 хвілін.
7. Дадайце 50 мкл стоп -раствора ў кожную лунку, каб спыніць рэакцыю.
8. Прачытайце паглынанне ў счытвальніку мікрапласці
Рэкамендуецца для больш высокай дакладнасці).