SARS-CoV-2 Neytrallaşdırıcı Anticisim Aşkarlama Dəsti (ELISA)
【PRİNSİP】
SARS-CoV-2 Neytrallaşdırıcı Anticisim Aşkarlama Kiti rəqabətədavamlı ELISA metodologiyasına əsaslanır.
Təmizlənmiş reseptor bağlayan domen (RBD), viral sünbül (S) zülalından və ana hüceyrədən zülaldan istifadə
reseptor ACE2, bu test virus-ev sahibi neytrallaşdırıcı qarşılıqlı əlaqəni təqlid etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.
Kalibratorlar, Keyfiyyətə Nəzarətlər və serum və ya plazma nümunələri ayrı-ayrılıqda seyreltmədə yaxşıca qarışdırılır
kiçik borulara bölünmüş hACE2-HRP konjugatı olan tampon.Sonra qarışıqlar içəriyə köçürülür
üçün immobilizə edilmiş rekombinant SARS-CoV-2 RBD fraqmentini (RBD) ehtiva edən mikroplitə quyuları
inkubasiya.30 dəqiqəlik inkubasiya zamanı kalibratorlardakı RBD spesifik antikor, QC və
nümunələr quyularda hərəkətsizləşdirilmiş RBD-nin spesifik bağlanması üçün hACE2-HRP ilə rəqabət aparacaq.sonra
inkubasiya zamanı quyular bağlanmamış hACE2-HRP konjuqatını çıxarmaq üçün 4 dəfə yuyulur.Bir həll
Sonra TMB əlavə edilir və otaq temperaturunda 20 dəqiqə inkubasiya edilir, nəticədə a
mavi rəng.Rəng inkişafı 1N HCl əlavə edilməklə dayandırılır və absorbans olur
450 nm-də spektrofotometrik olaraq ölçüldü.Yaranan rəngin intensivliyi ilə mütənasibdir
mövcud olan fermentin miqdarıdır və eyni şəkildə yoxlanılan standartların miqdarı ilə tərs bağlıdır.
Təqdim olunan kalibratorların yaratdığı kalibrləmə əyrisi ilə müqayisə yolu ilə konsentrasiyası
sonra naməlum nümunədə neytrallaşdırıcı antikorlar hesablanır.
【TƏLƏB OLAN, AMMA TƏQDİM EDİLMƏYƏN MATERİALLAR】
1. Distillə edilmiş və ya deionlaşdırılmış su
2. Dəqiq pipetlər: 10μL, 100μL, 200μL və 1 mL
3. Birdəfəlik istifadə olunan pipet ucları
4. 450nm-də udma qabiliyyətini oxuya bilən mikroplata oxuyucusu.
5. Absorbent kağız
6. Qrafik kağız
7. Vorteks qarışdırıcı və ya ekvivalenti
【NÜMUNƏNİN YOPLANMASI VƏ SAXLANMASI】
1. Tərkibində K2-EDTA olan borularda toplanmış serum və plazma nümunələri bu dəst üçün istifadə edilə bilər.
2. Nümunələr qapaqla bağlanmalıdır və analizdən əvvəl 2 °C - 8 °C temperaturda 48 saata qədər saxlanıla bilər.
Daha uzun müddət (6 aya qədər) saxlanılan nümunələr analizdən əvvəl yalnız bir dəfə -20 °C-də dondurulmalıdır.
Təkrarlanan dondurma-ərimə dövrlərindən çəkinin.
PROTOKOL
【Reagentin hazırlanması】
1. İstifadədən əvvəl bütün reagentlər soyuducudan çıxarılmalı və otaq temperaturuna qaytarılmalıdır
(20°-dən 25°C-yə qədər).İstifadədən dərhal sonra bütün reagentləri soyuducuda saxlayın.
2. İstifadədən əvvəl bütün nümunələr və nəzarətlər burulğan edilməlidir.
3. hACE2-HRP məhlulunun hazırlanması: hACE2-HRP konsentratını 1:51 nisbətində seyreltmə ilə seyreltin.
Bufer.Məsələn, 100 μL hACE2-HRP konsentratını 5,0 mL HRP Seyreltmə Buferi ilə seyreltin.
hACE2-HRP məhlulu hazırlayın.
4. 1× Yuma Məhlulunun Hazırlanması: 20× Yuma Məhlulunu deionlaşdırılmış və ya distillə edilmiş su ilə seyreltin.
həcm nisbəti 1:19.Məsələn, 20 ml 20 × Yuma məhlulunu 380 ml deionlaşdırılmış və ya
distillə edilmiş su ilə 400 mL 1× Yuma məhlulu hazırlayın.
【Test Proseduru】
1. Ayrı-ayrı borularda hazırlanmış hACE2-HRP məhlulunun 120μL hissəsini ayırın.
2. Hər boruya 6 μL kalibrator, naməlum nümunələr, keyfiyyət nəzarəti əlavə edin və yaxşı qarışdırın.
3. 2-ci addımda hazırlanmış hər qarışığın 100 μL-ni müvafiq olaraq müvafiq mikroplitə quyularına köçürün.
əvvəlcədən hazırlanmış test konfiqurasiyasına.
3. Plitəni Plate Sealer ilə örtün və 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin.
4. Plitə möhürləyicisini çıxarın və boşqabı hər quyu üçün təxminən 300 μL 1× Yuma Məhlulu ilə dörd dəfə yuyun.
5. Yuma addımlarından sonra quyularda qalıq mayeni çıxarmaq üçün boşqabın üzərinə kağız dəsmalla vurun.
6. Hər quyuya 100 μL TMB Məhlulu əlavə edin və boşqabı qaranlıqda 20 - 25°C temperaturda 20 dəqiqə inkubasiya edin.
7. Reaksiyanı dayandırmaq üçün hər quyuya 50 μL Stop Solution əlavə edin.
8. Mikroplitə oxuyucusunda 10 dəqiqə ərzində 450 nm-də absorbansı oxuyun (aksesuar olaraq 630 nm).
daha yüksək dəqiqlik üçün tövsiyə olunur).
