مجموعة أدوات الكشف عن الأجسام المضادة المعادلة لـ SARS-CoV-2 (ELISA)
【مبدأ】
تعتمد مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة المعادلة لـ SARS-CoV-2 على منهجية ELISA التنافسية.
باستخدام مجال ربط المستقبلات المنقى (RBD)، والبروتين من بروتين السنبلة الفيروسية (S) والخلية المضيفة
مستقبل ACE2، تم تصميم هذا الاختبار لتقليد تفاعل تحييد مضيف الفيروس.
يتم خلط المعايرات وضوابط الجودة وعينات المصل أو البلازما بشكل فردي بشكل جيد في التخفيف
المخزن المؤقت الذي يحتوي على مترافق hACE2-HRP في أنابيب صغيرة.ثم يتم نقل المخاليط
آبار الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على جزء RBD المؤتلف من SARS-CoV-2 (RBD) من أجل
حضانة.خلال فترة الحضانة لمدة 30 دقيقة، يتم اكتشاف الأجسام المضادة المحددة لـ RBD في المعايرات ومراقبة الجودة و
سوف تتنافس العينات مع hACE2-HRP لربط RBD المحدد في الآبار.بعد
في الحضانة، يتم غسل الآبار 4 مرات لإزالة مترافق hACE2-HRP غير المنضم.حل
يتم بعد ذلك إضافة TMB وحضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مما يؤدي إلى تطور أ
اللون الأزرق.يتم إيقاف تطور اللون بإضافة 1N HCl، ويتم إيقاف الامتصاص
تم قياسه طيفيًا عند 450 نانومتر.تتناسب شدة اللون المتشكل مع
كمية الإنزيم الموجود، وترتبط عكسيا مع كمية المعايير التي تم فحصها بنفس الطريقة.
من خلال المقارنة مع منحنى المعايرة الذي شكلته المعايرات المتوفرة، تم تحديد تركيز
ثم يتم حساب الأجسام المضادة المعادلة في العينة غير المعروفة.
【المواد المطلوبة ولكن لم يتم توفيرها】
1. الماء المقطر أو منزوع الأيونات
2. الماصات الدقيقة: 10μL، 100μL، 200μL و1 مل
3. نصائح ماصة يمكن التخلص منها
4. قارئ صفيحة ميكروية قادر على قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر.
5. ورق ماص
6. ورق الرسم البياني
7. الخلاط الدوامي أو ما يعادله
【جمع العينات وتخزينها】
1. يمكن استخدام عينات المصل والبلازما المجمعة في أنابيب تحتوي على K2-EDTA في هذه المجموعة.
2. يجب تغطية العينات ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى 48 ساعة عند درجة حرارة 2 - 8 درجات مئوية قبل الفحص.
يجب تجميد العينات التي تم الاحتفاظ بها لفترة أطول (تصل إلى 6 أشهر) مرة واحدة فقط عند -20 درجة مئوية قبل الفحص.
تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
بروتوكول
【تحضير الكاشف】
1. يجب إخراج جميع الكواشف من الثلاجة والسماح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام
(20 درجة إلى 25 درجة مئوية).احفظ جميع الكواشف في الثلاجة فورًا بعد الاستخدام.
2. ينبغي دوامة جميع العينات والضوابط قبل الاستخدام.
3. إعداد الحل hACE2-HRP: تمييع التركيز hACE2-HRP بنسبة 1: 51 التخفيف مع التخفيف
متعادل.على سبيل المثال، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من تركيز hACE2-HRP مع 5.0 مل من محلول تخفيف HRP إلى
جعل الحل hACE2-HRP.
4. 1 × تحضير محلول الغسيل: قم بتخفيف محلول الغسيل 20 × بالماء منزوع الأيونات أو المقطر مع
نسبة الحجم 1:19.على سبيل المثال، قم بتخفيف 20 مل من محلول الغسيل 20× مع 380 مل من المحلول منزوع الأيونات أو
الماء المقطر لصنع 400 مل من محلول الغسيل × 1.
【إجراء الاختبار】
1. في أنابيب منفصلة، قسمة 120 ميكرولتر من محلول hACE2-HRP المُجهز.
2. أضف 6 ميكرولتر من المعايرات والعينات غير المعروفة وضوابط الجودة في كل أنبوب واخلط جيدًا.
3. قم بنقل 100 ميكرولتر من كل خليط تم إعداده في الخطوة 2 إلى آبار الصفيحة الدقيقة المقابلة وفقًا لذلك
لتكوين الاختبار المصمم مسبقًا.
3. قم بتغطية الطبق بطبقة مانعة للتسرب واحضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. قم بإزالة سدادة اللوحة واغسل اللوحة بحوالي 300 ميكرولتر من محلول الغسيل × 1 لكل بئر لمدة أربع مرات.
5. اضغط على اللوحة على منشفة ورقية لإزالة السائل المتبقي في الآبار بعد خطوات الغسيل.
6. أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB إلى كل بئر واحضن الطبق في الظلام عند درجة حرارة 20 - 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
7. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر لإيقاف التفاعل.
8. اقرأ الامتصاص في قارئ الصفيحة الدقيقة عند 450 نانومتر خلال 10 دقائق (630 نانومتر كملحق
يوصى به للحصول على أداء عالي الدقة).
