SARS-CoV-2 ገለልተኛ ፀረ-ሰው ማወቂያ መሣሪያ (ELISA)
【መርህ】
የ SARS-CoV-2 ገለልተኛ ፀረ ሰው ማወቂያ ስብስብ በተወዳዳሪ ELISA ዘዴ ላይ የተመሰረተ ነው።
የተጣራ ተቀባይ ማሰሪያ ዶሜይን (RBD) በመጠቀም፣ ከቫይራል ስፒክ (ኤስ) ፕሮቲን እና ከሆድ ሴል ፕሮቲን
ተቀባይ ACE2፣ ይህ ምርመራ የቫይረሱ-አስተናጋጁን ገለልተኛ መስተጋብር ለመኮረጅ ነው።
ካሊብሬተሮች፣ የጥራት ቁጥጥሮች እና የሴረም ወይም የፕላዝማ ናሙናዎች በተናጥል በደንብ ተቀላቅለዋል።
በትናንሽ ቱቦዎች ውስጥ የተቀመጠ hACE2-HRP conjugate የያዘ ቋት። ከዚያ ድብልቅዎቹ ወደ ውስጥ ይተላለፋሉ
የማይንቀሳቀስ ድጋሚ ሳርርስ-ኮቪ-2 RBD ቁርጥራጭ (RBD) የያዙ ማይክሮፕሌት ጉድጓዶች ለ
መፈልፈያ. በ30-ደቂቃው መፈልፈያ ወቅት፣ በካሊብሬተሮች ውስጥ ያለው RBD የተወሰነ ፀረ እንግዳ አካል፣ QC እና
ናሙናዎች ከ hACE2-HRP ጋር ይወዳደራሉ በጉድጓዶቹ ውስጥ የማይንቀሳቀስ RBD ለተወሰነ ትስስር። በኋላ
ማቀፊያው፣ ያልታሰሩ hACE2-HRP conjugateን ለማስወገድ ጉድጓዶቹ 4 ጊዜ ይታጠባሉ። መፍትሄ የ
ከዚያም ቲኤምቢ ተጨምሮ ለ 20 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ መጨመር, በዚህም ምክንያት የ a
ሰማያዊ ቀለም. የቀለም እድገቱ ከ 1 ኤን ኤች.ኤል.ኤል በተጨማሪ ይቆማል, እና መምጠጥ ነው
በ 450 nm በ spectrophotometrically ይለካል. የተፈጠረው ቀለም ጥንካሬ ከ ጋር ተመጣጣኝ ነው
የኢንዛይም መጠን አለ ፣ እና በተመሳሳይ መንገድ ከተገመቱት ደረጃዎች ጋር በተገላቢጦሽ ይዛመዳል።
በቀረቡት የካሊብሬተሮች ከተፈጠረው የካሊብሬሽን ከርቭ ጋር በማነፃፀር፣ የ
በማይታወቅ ናሙና ውስጥ ፀረ እንግዳ አካላትን ገለልተኛ ማድረግ ከዚያም ይሰላል.
【አስፈላጊ ቁሳቁሶች ግን አልተሰጡም።】
1. የተጣራ ወይም የተጣራ ውሃ
2. ትክክለኛ ቧንቧዎች: 10μL, 100μL,200μL እና 1ml
3. ሊጣሉ የሚችሉ የ pipette ምክሮች
4. ማይክሮፕሌት አንባቢ በ 450nm የመምጠጥ ችሎታን ማንበብ ይችላል.
5. የሚስብ ወረቀት
6. ግራፍ ወረቀት
7. የቮርቴክስ ማደባለቅ ወይም ተመጣጣኝ
【የናሙና ስብስብ እና ማከማቻ】
1. K2-EDTA በያዙ ቱቦዎች ውስጥ የሚሰበሰቡ የሴረም እና የፕላዝማ ናሙናዎች ለዚህ ኪት መጠቀም ይችላሉ።
2. ናሙናዎች መሸፈን አለባቸው እና ከመመርመሩ በፊት እስከ 48 ሰአታት በ 2 ° ሴ - 8 ° ሴ ውስጥ መቀመጥ አለባቸው.
ረዘም ላለ ጊዜ (እስከ 6 ወር) የተያዙ ናሙናዎች ከመመርመሩ በፊት በ -20 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ አንድ ጊዜ ብቻ በረዶ መሆን አለባቸው.
ተደጋጋሚ የቀዝቃዛ ዑደቶችን ያስወግዱ።
ፕሮቶኮል
【Reagent ዝግጅት】
1. ሁሉም ሪኤጀንቶች ከማቀዝቀዣ ውስጥ መውጣት እና ከመጠቀምዎ በፊት ወደ ክፍል ሙቀት እንዲመለሱ መፍቀድ አለባቸው
(ከ 20 እስከ 25 ° ሴ). ከተጠቀሙ በኋላ ወዲያውኑ ሁሉንም ሬጀንቶችን በማቀዝቀዣ ውስጥ ያስቀምጡ።
2. ሁሉም ናሙናዎች እና መቆጣጠሪያዎች ከመጠቀምዎ በፊት መወዛወዝ አለባቸው.
3. hACE2-HRP የመፍትሄ ዝግጅት፡ የ hACE2-HRP ትኩረትን በ1፡51 የሟሟ መጠን ከ Dilution ጋር ይቀንሱ።
ቋት ለምሳሌ፣ 100 μL hACE2-HRP ትኩረትን በ 5.0ml HRP Dilution Buffer ወደ
የ hACE2-HRP መፍትሄ ያዘጋጁ.
4. 1× Wash Solution ዝግጅት፡- 20× Wash መፍትሄውን በዲዮኒዝድ ወይም በተጣራ ውሃ ይቅፈሉት
የ1፡19 የድምጽ መጠን። ለምሳሌ 20 ሚሊ 20 × Wash መፍትሄ በ 380 ሚሊር ዲዮኒዝድ ወይም
የተጣራ ውሃ 400 ሚሊ ሊትር 1 × Wash Solution.
【የሙከራ ሂደት】
1. በተለየ ቱቦዎች ውስጥ, ከተዘጋጀው hACE2-HRP መፍትሄ መካከል aliquot 120μL.
2. በእያንዳንዱ ቱቦ ውስጥ 6 μL የካሊብሬተሮችን, ያልታወቁ ናሙናዎችን, የጥራት መቆጣጠሪያዎችን ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቀሉ.
3. በደረጃ 2 የተዘጋጀውን እያንዳንዱን ድብልቅ 100μL ወደ ተጓዳኝ ማይክሮፕሌት ጉድጓዶች ያስተላልፉ
አስቀድሞ የተነደፈ የሙከራ ውቅር።
3. ሳህኑን በፕላት ማሸጊያው ላይ ይሸፍኑ እና በ 37 ° ሴ ለ 30 ደቂቃዎች ያፍሱ.
4. የፕሌት ማተሚያውን ያስወግዱ እና ሳህኑን በግምት 300 μL 1 × Wash Solution በአንድ ጉድጓድ ለአራት ጊዜ ያጠቡ።
5. ደረጃዎችን ከታጠበ በኋላ በጉድጓድ ውስጥ ያለውን ቀሪ ፈሳሽ ለማስወገድ ሳህኑን በወረቀት ፎጣ መታ ያድርጉት።
6. 100 μL የቲኤምቢ መፍትሄ በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ ይጨምሩ እና ሳህኑን በጨለማ በ 20 - 25 ° ሴ ለ 20 ደቂቃዎች ያፍሱ.
7. ምላሹን ለማቆም በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50 μL Stop Solution ይጨምሩ.
8. የማይክሮፕሌት አንባቢውን በ 450 nm በ10 ደቂቃ ውስጥ አንብብ (630nm እንደ መለዋወጫ)
ለከፍተኛ ትክክለኛነት የሚመከር).