SARS-CoV-2 neutraliserende teenliggaamopsporingstel (ELISA)
【BEGINSEL】
Die SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Detection Kit is gebaseer op mededingende ELISA-metodologie.
Gebruik gesuiwerde reseptorbindingsdomein (RBD), proteïen van die virale piek (S) proteïen en die gasheersel
reseptor ACE2, is hierdie toets ontwerp om die virus-gasheer neutraliserende interaksie na te boots.
Kalibreerders, kwaliteitskontroles en serum- of plasmamonsters word individueel goed gemeng in verdunning
buffer wat hACE2-HRP-konjugaat bevat, verdeel in klein buisies. Dan word die mengsels oorgedra
die mikroplaatputte wat geïmmobiliseerde rekombinante SARS-CoV-2 RBD-fragment (RBD) bevat vir
inkubasie. Tydens die 30-minute inkubasie, die RBD spesifieke teenliggaampies in die kalibrators, QC en
monsters sal kompeteer met die hACE2-HRP vir spesifieke binding van die RBD wat in die putte geïmmobiliseer is. Na
die inkubasie, word die putte 4 keer gewas om ongebonde hACE2-HRP-konjugaat te verwyder. N oplossing van
TMB word dan bygevoeg en vir 20 minute by kamertemperatuur geïnkubeer, wat lei tot die ontwikkeling van a
blou kleur. Die kleurontwikkeling word gestop met die byvoeging van 1N HCl, en die absorpsie is
spektrofotometries gemeet by 450 nm. Die intensiteit van die kleur wat gevorm word, is eweredig aan die
hoeveelheid ensiem teenwoordig, en is omgekeerd verwant aan die hoeveelheid standaarde wat op dieselfde manier getoets word.
Deur vergelyking met die kalibrasiekurwe wat deur die verskafde kalibreerders gevorm word, kan die konsentrasie van
neutraliserende teenliggaampies in die onbekende monster word dan bereken.
【MATERIALE BENODIG, MAAR NIE VERSKAF NIE】
1. Gedistilleerde of gedeïoniseerde water
2. Presisiepipette: 10μL, 100μL, 200μL en 1 mL
3. Weggooibare pipetpunte
4. Mikroplaatleser wat absorbansie by 450nm kan lees.
5. Absorberende papier
6. Grafiekpapier
7. Vortex-menger of ekwivalent
【MONSTER VERSAMELING EN BERGING】
1. Serum- en plasmamonsters versamel in buise wat K2-EDTA bevat, kan vir hierdie stel gebruik word.
2. Monsters moet bedek wees en kan vir tot 48 uur by 2 °C - 8 °C gestoor word voor bepaling.
Monsters wat vir 'n langer tyd (tot 6 maande) gehou word, moet slegs een keer by -20 °C gevries word voor die toets.
Vermy herhaalde vries-ontdooi siklusse.
PROTOKOL
【Reagensvoorbereiding】
1. Alle reagense moet uit verkoeling gehaal word en toegelaat word om na kamertemperatuur terug te keer voor gebruik
(20° tot 25°C). Stoor alle reagense onmiddellik na gebruik in yskas.
2. Alle monsters en kontroles moet gevortex word voor gebruik.
3. hACE2-HRP Oplossing Voorbereiding: Verdun hACE2-HRP konsentraat teen 1:51 verdunningsverhouding met Verdunning
Buffer. Verdun byvoorbeeld 100 μL hACE2-HRP-konsentraat met 5.0mL HRP-verdunningsbuffer om
maak 'n hACE2-HRP oplossing.
4. 1× Wasoplossing Voorbereiding: Verdun die 20× Wasoplossing met gedeïoniseerde of gedistilleerde water met 'n
volumeverhouding van 1:19. Verdun byvoorbeeld 20 ml 20× wasoplossing met 380 ml gedeïoniseerde of
gedistilleerde water om 400 ml 1× wasoplossing te maak.
【Toetsprosedure】
1. In aparte buise, deel 120μL van die voorbereide hACE2-HRP-oplossing in.
2. Voeg 6 μL kalibreerders, onbekende monsters, kwaliteitkontroles in elke buis by en meng goed.
3. Dra 100μL van elke mengsel wat in stap 2 voorberei is oor in ooreenstemmende mikroplaatputte volgens
na vooraf ontwerpte toetskonfigurasie.
3. Bedek die plaat met Plate Sealer en inkubeer by 37°C vir 30 minute.
4. Verwyder die Plaatverseëlaar en was die plaat met ongeveer 300 μL 1× Wasoplossing per put vir vier keer.
5. Tik die plaat op papierhanddoek om oorblywende vloeistof in die putte te verwyder na wasstappe.
6. Voeg 100 μL TMB-oplossing by elke put en inkubeer die plaat in donker by 20 - 25°C vir 20 minute.
7. Voeg 50 μL stopoplossing by elke put om die reaksie te stop.
8. Lees die absorpsie in mikroplaatleser by 450 nm binne 10 minute (630 nm as bykomstigheid is
aanbeveel vir hoër presisie prestasie).